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文檔簡介
1、本課題通過不同濃度異氟醚作用于母體,確定可引發(fā)胎鼠神經(jīng)損傷的濃度;通過不同劑量復(fù)合應(yīng)用右美托咪定,探討右美托咪定有效作用的劑量和方法;采取行為學(xué)方法評價異氟醚對胎鼠的神經(jīng)損傷和右美托咪定的保護作用;通過透射電鏡(Tansmission electron microscopy,TEM)觀察大腦超微結(jié)構(gòu),及采用免疫組化實驗檢測BDNF及突觸素(Synaptophysin,Syn),探討其可能的作用機制。旨在探索右美托咪定有效減輕胎兒期全麻藥
2、神經(jīng)損傷的方法和劑量,為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
第一部分不同濃度異氟醚長時間吸入致妊娠中期胎鼠大腦異常凋亡
目的:
模擬妊娠中期婦女非產(chǎn)科手術(shù)的臨床麻醉,對妊娠第14天母鼠進行長時間吸入異氟醚麻醉,觀察不同濃度的異氟醚對胎兒神經(jīng)系統(tǒng)的影響。
方法:
實驗對象為50只定時受孕的SD雌性大鼠,以及其各自的胎鼠。每只母鼠隨機選擇2個孕囊,分離出胎鼠,4%多聚甲醛固定后于距額部2mm處取大腦組織
3、切片。TUNEL法檢測胎鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡量,計算凋亡細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)的比率。
結(jié)果:
與Control組比較,吸入異氟醚的各組,凋亡細(xì)胞比率均呈升高,具有顯著性,與Iso2.0組比較,Iso1.5組與其相似(P>0.05);Control組、Oxy組呈顯著降低。
結(jié)論:
1.妊娠第14天,母鼠持續(xù)吸入1%、1.5%、2%三種濃度異氟醚4h,胎鼠大腦神經(jīng)元均可于4h后凋亡顯著增加。
2.母鼠
4、吸入異氟醚致胎鼠大腦神經(jīng)元凋亡增加作用可能存在劑量依賴性。
3.母鼠吸入純氧4h并不增加4h后胎鼠大腦神經(jīng)元凋亡。
第二部分不同劑量右美托咪定對異氟醚致妊娠中期胎鼠神經(jīng)元異常凋亡的保護作用
目的:
評價應(yīng)用右美托咪定對妊娠第14天胎鼠長時間異氟醚暴露所致神經(jīng)損傷是否具有保護作用,以及探討其可能的機制。
方法:
實驗對象為70只定時受孕的SD雌性大鼠,以及其各自的胎鼠。
5、 吸入氣體結(jié)束4h后,母鼠使用水合氯醛麻醉,行剖宮取胎術(shù)。每只母鼠隨機選擇2個孕囊,分離出胎鼠,4%多聚甲醛固定后于距額部2mm處取大腦組織連續(xù)切片。TUNEL法檢測胎鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡量,計算凋亡細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)的比率。免疫組化方法檢測大腦BDNF、Syn表達水平,計算單位面積平均光密度(Mean optical density,MOD)值。
結(jié)果:
與NS+Iso組比較,Dex10+Iso組、 Dex20+Iso組、
6、Dex20+Oxy組及Control組均呈顯著降低,Dex5+Iso組雖低于NS+Iso組,但差異未有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義;Dex20+Yoh+Iso組與NS+Iso組相似。與Dex20+Yoh+Iso組比較,Dex5+Iso組、Dex10+Iso組及Dex20+Iso組均顯著降低。
各組胎鼠大腦的Syn表達MOD值相接近,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.130,P=0.356)。
結(jié)論:
1.應(yīng)用右美托咪定10μg
7、/kg、20μg/kg兩種劑量進行預(yù)處理和吸入中追加給藥,可減少子宮內(nèi)胎鼠1.5%異氟醚暴露4h所致神經(jīng)元異常凋亡作用。
2.右美托咪定通過激動α2-AR起神經(jīng)保護作用,此作用可被育亨賓所拮抗。
3.右美托咪定的神經(jīng)保護作用可能存在劑量依賴性。
4.右美托咪定可上調(diào)胎鼠大腦BDNF表達,BDNF上調(diào)產(chǎn)生的級聯(lián)反應(yīng)可能參與右美托咪定的神經(jīng)保護作用。
5.子宮內(nèi)胎鼠1.5%異氟醚暴露4h,無論是否復(fù)合
8、使用右美托咪定,均未觀察Syn表達顯著改變。
6.單獨使用右美托咪定不引起胎鼠大腦凋亡增加,對BDNF、Syn表達無影響。
第三章 右美托咪定對子宮內(nèi)胎鼠異氟醚暴露神經(jīng)保護作用至大鼠成年期的影響
目的:
通過行為學(xué)實驗,評價應(yīng)用右美托咪定對妊娠第14天胎鼠長時間異氟醚暴露所致胎鼠神經(jīng)損傷的保護作用是否延續(xù)至成年期,并以解剖學(xué)和免疫組化方法探討其可能的機制。
方法:
實驗對象為5
9、0只定時受孕的SD雌性大鼠,以及其各自的雄性子鼠。
行為學(xué)實驗結(jié)束后,擬行電鏡分析子鼠腹腔內(nèi)注射水合氯醛麻醉,于冰面上取其大腦海馬CA1區(qū)組織行透射電鏡分析,于13500倍鏡下,記錄突觸計數(shù);于46000倍鏡下,觀察突觸形態(tài),并測量突觸間隙和突觸后致密物厚度。擬行免疫組化實驗子鼠腹腔內(nèi)注射水合氯醛麻醉,經(jīng)心臟灌注固定液后解剖取大腦組織進行免疫組化實驗,分別檢測Syn、BDNF的表達程度,計算其MOD值。
行為學(xué)數(shù)據(jù)及
10、實驗室數(shù)據(jù)使用盲法采集,同母2只子鼠行為學(xué)實驗數(shù)據(jù)取其平均值納入統(tǒng)計。計量資料以(x)±s表示,采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析。Morris水迷宮實驗中第1天至第4天的潛伏時間使用重復(fù)測量資料方差分析,使用LSD法進一步行組間比較;其余數(shù)據(jù)使用單因素方差分析,組間比較使用LSD法,P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
結(jié)果:
曠場實驗中,各組子鼠活動距離和平均速度無統(tǒng)計學(xué)差異(F=0.339,P=0.850; F=
11、0.393,P=0.812)。各組子鼠間大便次數(shù)有顯著差異(F=5.203,P=0.002),Dex+Iso組與Dex+Oxy組及Control組相似(P>0.05),顯著少于NS+Iso組(P<0.05);而Dex+Yoh+Iso組則和NS+Iso組相似(P>0.05),顯著高于Control組(P<0.05);Dex+Iso組大便次數(shù)雖低于Dex+Yoh+Iso組,但差異未有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
Morris水
12、迷宮中,大鼠前4天行定向航行實驗,各組大鼠潛伏期時間于不同天數(shù)間有顯著差異(F=99.348,P<0.001),于第1天最高,第4天最低;各組于第1、2天潛伏期時間相似(F=0.211,P=0.931; F=0.155,P=0.960),于第3、4天有顯著差異(F=2.957,P=0.030; F=4.173,P=0.006)。進一步對同一天內(nèi)組間數(shù)據(jù)行兩兩比較,可見第3天,Dex+Iso組與其余各組均無顯著性差異(P>0.05);De
13、x+Yoh+Iso組則與NS+Iso組相似(P>0.05),顯著高于Control組(P<0.05);Dex+Oxy組和Control組相似(P>0.05),顯著低于NS+Iso組(P<0.05)。第4天,Dex+Iso組、Dex+Oxy組與Control組相似(P>0.05),顯著低于NS+Iso組;Dex+Yoh+Iso組與NS+Iso組相似(P>0.05),顯著高于Control組(P<0.05);Dex+Iso組顯著低于Dex+
14、Yoh+Iso組(P<0.05)。第5天行單次隱匿平臺尋找實驗,可見各組子鼠首次穿越平臺位置時間和穿越次數(shù)有顯著差異(F=3.124,P=0.024;F=4.146,P=0.006),Dex+Iso組、Dex+Oxy組首次穿越平臺位置時間和Control組相似(P>0.05),顯著低于NS+Iso組(P<0.05);NS+Iso和Dex+Yoh+Iso組顯著高于Control組(P<0.05);Dex+Iso組顯著低于Dex+Yoh+I
15、so組(P<0.05)。Dex+Iso組、Dex+Oxy組穿越次數(shù)和Control組相似(P>0.05),顯著多于NS+Iso組(P<0.05);NS+Iso和Dex+Yoh+Iso組顯著少于Control組(P<0.05);Dex+Iso組顯著多于Dex+Yoh+Iso組(P<0.05)。
電鏡分析結(jié)果,各組大鼠突觸個數(shù)有顯著差異(F=15.771,P<0.001)。Dex+Iso組、Dex+Oxy組與Control組相似(
16、P>0.05),均顯著多于NS+Iso組(P<0.05);而NS+Iso組和Dex+Yoh+Iso組相似(P>0.05),均顯著低于Control組(P<0.05)。Dex+Iso組顯著多于Dex+Yoh+Iso組(P<0.05)。各組子鼠突觸間隙寬度及突觸后致密物厚度無統(tǒng)計學(xué)差異(F=0.119,P=0.975; F=0.638,P=0.638)。
免疫組化實驗結(jié)果,各組間Syn表達MOD值有顯著差異(F=4.590,P=0
17、.003),Dex+Iso組、Dex+Oxy組和Control組相似(P>0.05),顯著高于NS+Iso組(P<0.05);而NS+Iso和Dex+Yoh+Iso組顯著低于Control組(P<0.05);Dex+Iso組顯著高于Dex+Yoh+Iso組(P<0.05)。各組大鼠BDNF表達MOD值無統(tǒng)計學(xué)差異(F=0.363,P=0.834)。
結(jié)論:
1.應(yīng)用右美托咪定20μg/kg進行預(yù)處理和吸入中追加給藥,
18、可對1.5%異氟醚暴露4h的子宮內(nèi)妊娠第14天雄性子鼠產(chǎn)生長期影響,表現(xiàn)在:
?、倏蓽p少因子宮內(nèi)異氟醚暴露所致成年期焦慮情緒上升、空間學(xué)習(xí)記憶能力下降等行為異常。
?、诳蓽p輕成年期大腦海馬CA1區(qū)的突觸數(shù)量下降及Syn表達下降。
2.右美托咪定對空間學(xué)習(xí)記憶能力的保護作用,及對突觸數(shù)量、Syn表達的保護作用,均可被育亨賓所拮抗。
3.單獨應(yīng)用右美托咪定對雄性子鼠成年期行為、突觸數(shù)量及Syn表達水平無顯
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