鹽酸右美托咪定預(yù)處理對大鼠高氧急性肺損傷的作用研究.pdf

1、目的：
　　1.建立大鼠高氧性急性肺損傷模型并進行效果評價。
　　2.觀察不同劑量的鹽酸右美托嘧啶對大鼠高氧急性肺損傷的作用及是否具有劑量依賴性。
　　3.PI3K/Akt信號傳導(dǎo)通路在右美托咪定對大鼠高氧急性肺損傷中的作用。
　　方法：
　　1.建立大鼠高氧急性肺損傷模型并進行效果評價。將80只SD大鼠隨機分為空氣組和高氧組，按照吸氧時間不同高氧組又隨機分為24h組、48h組、72h組3個亞組，共4組，每

2、組20只；空氣組放置于空氣中喂養(yǎng)，高氧組放置于高氧箱中喂養(yǎng)，高氧箱中溫度設(shè)置在25℃，箱中濕度保持在50％，高氧箱中氧濃度持續(xù)保持在90%，箱內(nèi)CO2濃度小于0.5%；箱內(nèi)放置鈉石灰、無水氯化鈣、溫度計、濕度計；每天持續(xù)不間斷給氧，分別在各時間點觀察大鼠精神狀態(tài)、進食、大鼠皮膚黏膜等大體情況?？諝饨M和高氧組各時間點分別抽大鼠動脈血進行血氣分析。打開胸腔顯露肺組織，肉眼觀察肺組織大體情況；取左下肺組織浸泡于10%福爾馬林標(biāo)本固定液中，行H

3、E染色，光鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化情況，并進行肺病理評分。取出完整的右肺組織用紙巾迅速拭干肺表面的血液及水分，放置于電子天平秤上測量濕/干（W/D）質(zhì)量比值；檢測血漿TNF-α和IL-1β、IL-6濃度變化情況。
　　2.觀察不同劑量的鹽酸右美托咪定對大鼠高氧急性肺損傷的作用是否具有劑量依賴性。建立大鼠高氧急性肺損傷模型，將動脈血氣分析、肺組織病理學(xué)檢查、肺細胞早期凋亡率作為評判指標(biāo)，討論不同劑量的鹽酸右美托咪定對大鼠高氧急性肺損

4、傷的作用是否有劑量依賴性。將80只健康SD大鼠隨機分為4組，即高氧肺損傷（HALI）組即(H組)、鹽酸右美托咪定2.5μg/(kg·h)組（DL）、鹽酸右美托咪定5μg/(kg·h)組（DM）、鹽酸右美托咪定10μg/(kg·h)組（DH），4組大鼠分別置于高氧箱中喂養(yǎng)48h后取標(biāo)本檢測。DL組給予右美托咪定2.5μg/(kg·h)，加入到20ml5%葡萄糖注射液中，0.5ml/h，尾靜脈持續(xù)泵入，立刻入高氧箱；DM組給予右美托咪定5μ

5、g/(kg·h)，加入到20ml5%葡萄糖注射液中，0.5ml/h，尾靜脈持續(xù)泵入，立刻入高氧箱；DH組給予右美托咪定10μg/(kg·h)加入20ml5%葡萄糖注射液中，0.5ml/h，尾靜脈持續(xù)泵入，立刻入高氧箱；H組給予等量的糖水，尾靜脈持續(xù)泵入，立刻入高氧箱。48h后造模結(jié)束，把各組大鼠從箱中取出，分別麻醉，逐一取頸動脈血，行血氣分析，分別計算氧合指數(shù)(OI)、呼吸指數(shù)(RI)；將左下肺組織置于10%福爾馬林標(biāo)本固定液中，行HE

6、染色，光鏡下觀察肺組織病理變化情況，并做肺病理評分；取右肺組織用流式細胞儀檢測法檢測肺細胞早期凋亡率。
　　3. PI3K/Akt信號傳導(dǎo)通路在右美托咪定對大鼠高氧急性肺損傷的作用。將80只健康SD大鼠隨機分為4組，即：高氧肺損傷(HALI)組即(H組)、DM（右美托咪定）組、WD（渥曼青霉素+右美托咪定）組、W（渥曼青霉素）組，將4組大鼠分別置于高氧箱中喂養(yǎng)。DM組給予右美托咪定5μg/(kg·h)，加入20ml5%葡萄糖注射液

7、中，0.5ml/h，尾靜脈持續(xù)泵入，立刻入高氧箱；WD組給予渥曼青霉素+右美托咪定，入高氧箱前先尾靜脈緩慢注射渥曼青霉素30μg/kg，后將右美托咪定5μg/(kg.h)加入到20ml5%葡萄糖注射液，0.5ml/h，尾靜脈持續(xù)泵入，立刻入高氧箱。W組先給于30μg/kg的渥曼青霉素，尾靜脈緩慢注射，后給予等量的5%葡萄糖注射液，0.5ml/h，尾靜脈持續(xù)泵入，立刻入高氧箱。H組給予等量、等速度的5%葡萄糖注射液，尾靜脈持續(xù)泵入，立刻后

8、入高氧箱。48h后造模結(jié)束，將各組大鼠取出，分別麻醉處死，打開胸腔，分別取出左右肺組織。將左肺放置于10%福爾馬林標(biāo)本固定液中，行HE染色，光鏡下觀察各組大鼠肺病理變化情況，并進行肺病理評分，將右肺用western blotting法檢測PI3K、AKT、P-Akt、GSK-3β、P-GSK-3β蛋白表達量。
　　結(jié)果：
　　1.
　?。?）肺組織大體觀察結(jié)果
　　空氣組，肺組織顏色均勻，呈粉紅色，未見出血點、組

9、織水腫及壞死表現(xiàn)，用手觸摸肺組織較柔軟有彈性。高氧組24h肺組織呈淡紅色，表面有極少量的、散在的，大小不等的點狀出血;高氧48h肺組織略顯暗紅，充血較明顯，略顯水腫，伴有少量的點狀或小片狀出血點；高氧72h肺組織損傷較嚴重，呈暗紅色，肺組織明顯水腫，肺表面可見多處斑片狀出血，個別損傷嚴重的，胸腔可見透亮的或淡紅色的胸腔積液，甚至口鼻處出現(xiàn)血性分泌物。
　?。?）肺組織HE染色結(jié)果及肺病理評分
　　空氣組肺泡結(jié)構(gòu)清晰完整，肺泡

10、大小均勻，肺泡壁光滑，肺泡腔內(nèi)未見白細胞及滲出物，肺泡間隔無增寬，無炎性細胞浸潤；高氧組24h肺泡結(jié)構(gòu)較清晰，肺泡腔內(nèi)有少量滲出液伴有少量紅細胞漏出，極少數(shù)有毛細血管擴張，肺泡間隔稍增厚；高氧48h肺泡腔內(nèi)滲出液明顯增多，有部分紅細胞漏出，肺組織毛細血管擴張明顯，少數(shù)肺泡腔變大，肺泡間隔明顯增厚，多數(shù)肺泡間隔斷裂伴有大量WBC滲出；高氧組72h大鼠肺組織彌漫性損傷，肺組織結(jié)構(gòu)顯示不清，肺泡壁斷裂融合成肺大泡；肺泡腔及肺間質(zhì)內(nèi)充滿WBC，

11、伴水腫，嚴重者有透明膜形成。各組肺組織病理學(xué)評分比較，DL、DM組與H組比較病理評分降低(P<0.05），DM組與DL組比較肺病理評分降低差異顯著(P<0.05)，DH組與H組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。
　?。?）血氣分析
　　空氣組氧合指數(shù)(OI)無明顯變化（P>0.05），高氧組隨高氧暴露時間延長OI逐漸降低與空氣組比較（P<0.05）；空氣組RI無明顯變化（P>0.05），高氧組隨高氧暴露時間延長RI逐漸升

12、高（P<0.05）。
　?。?）血漿炎性因子
　　空氣組隨時間延長血漿IL-1β、IL-6、TNF-α濃度無明顯改變（P>0.05），高氧組隨時間延長IL-β、IL-6、TNF-α濃度逐漸升高（P<0.05）。
　?。?）肺組織W/D比值
　　空氣組肺組織W/D無明顯變化（P>0.05），高氧組隨時間延長肺組織W/D比值逐漸升高（P<0.05）。
　　2.
　?。?）肺組織細胞早期凋亡率
　　D

13、L、DM組與H組比較，肺組織早期凋亡率均有降低(P<0.05)，但DM組與DL組比較早期凋亡率降低差異顯著(P<0.05)，DH組與H組比較肺組織細胞早期凋亡率無明顯差異（P>0.05），DM與DH組比較肺組織細胞早期凋亡率降低差異顯著(P<0.05)。去掉超安全劑量DH組后呈線性變化趨勢（P<0.05）。
　　（2）肺組織病理學(xué)變化與肺病理學(xué)評分
　　H組肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡壁明顯增厚，個別肺泡壁斷裂，部分融合成肺大泡，肺泡

14、間隔明顯水腫、增寬、可見大量炎性細胞滲出；DH組肺組織結(jié)構(gòu)稍紊亂，部分肺泡壁斷裂，并融合成肺大泡，肺泡間隔有明顯的炎癥細胞浸潤，表現(xiàn)同H組；DM組肺泡結(jié)構(gòu)較清晰，肺組織少許充血水腫，呈暗紅色，肺表面有少量點狀出血，肺泡間隔有極少數(shù)炎性細胞浸潤。各組肺組織病理學(xué)評分和病理學(xué)變化結(jié)果趨勢一致。DL、DM組與H組比較(P<0.05)；DH組與H組比較(P>0.05)，DM組與DH組比較差異顯著(P<0.05)。去掉超安全劑量DH組后呈線性變化

15、趨勢。
　?。?）血氣分析
　　DL、DM組與H組RI比較（P>0.05）；DL、DM組與H組OI比較(P<0.05)。去掉超安全劑量DH組后呈線性變化趨勢（P<0.05）。
　　3.
　　（1）肺組織肺病理學(xué)變化與肺病理評分
　　H組肺泡組織損傷面積廣泛，個別肺泡結(jié)構(gòu)顯示不清，肺泡腔及肺間質(zhì)內(nèi)充滿大量白細胞，伴透明膜形成。DM組擴張的肺毛細血管內(nèi)充血，伴隨白細胞粘附，肺泡腔內(nèi)有滲出液和大量紅細胞漏出。部分

16、肺泡間隔增厚伴有肺泡間隔斷裂，周圍有大量白細胞聚集呈滲出改變。WD組病理學(xué)改變同H組。各組肺病理評分和肺病理學(xué)變化趨勢一致。使用和未使用右美托咪定的效果有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05），使用和未使用渥曼青霉素的效果有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05），且二者存在交互作用，即渥曼青霉素能夠影響右美托咪定藥物作用效果（P<0.05）。
　?。?）蛋白印跡結(jié)果
　　在PI3KP110、p-AKT和p-GSK-3β的表達中，以右美托咪定為主效應(yīng)

17、結(jié)果提示P<0.05，使用與未用右美托咪定的差異有統(tǒng)計學(xué)意義。渥曼青霉素主效應(yīng)結(jié)果提示P<0.05，使用與未用渥曼青霉素的差異有統(tǒng)計學(xué)意義；二者交互效應(yīng)結(jié)果提示P<0.05，即二者存在交互作用。
　　在PI3KP85、AKT和GSK-3β的表達中，以右美托咪定為主效應(yīng)結(jié)果提示P>0.05，使用與未用右美托咪定的差異無統(tǒng)計學(xué)意義；渥曼青霉素主效應(yīng)結(jié)果提示P>0.05，使用與未用渥曼青霉素的差異無統(tǒng)計學(xué)意義；二者交互效應(yīng)結(jié)果提示P>0