鹽酸右美托咪定預(yù)處理對(duì)大鼠高氧急性肺損傷的作用研究.pdf

1、目的：
　　1.建立大鼠高氧性急性肺損傷模型并進(jìn)行效果評(píng)價(jià)。
　　2.觀察不同劑量的鹽酸右美托嘧啶對(duì)大鼠高氧急性肺損傷的作用及是否具有劑量依賴(lài)性。
　　3.PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路在右美托咪定對(duì)大鼠高氧急性肺損傷中的作用。
　　方法：
　　1.建立大鼠高氧急性肺損傷模型并進(jìn)行效果評(píng)價(jià)。將80只SD大鼠隨機(jī)分為空氣組和高氧組，按照吸氧時(shí)間不同高氧組又隨機(jī)分為24h組、48h組、72h組3個(gè)亞組，共4組，每

2、組20只；空氣組放置于空氣中喂養(yǎng)，高氧組放置于高氧箱中喂養(yǎng)，高氧箱中溫度設(shè)置在25℃，箱中濕度保持在50％，高氧箱中氧濃度持續(xù)保持在90%，箱內(nèi)CO2濃度小于0.5%；箱內(nèi)放置鈉石灰、無(wú)水氯化鈣、溫度計(jì)、濕度計(jì)；每天持續(xù)不間斷給氧，分別在各時(shí)間點(diǎn)觀察大鼠精神狀態(tài)、進(jìn)食、大鼠皮膚黏膜等大體情況。空氣組和高氧組各時(shí)間點(diǎn)分別抽大鼠動(dòng)脈血進(jìn)行血?dú)夥治?。打開(kāi)胸腔顯露肺組織，肉眼觀察肺組織大體情況；取左下肺組織浸泡于10%福爾馬林標(biāo)本固定液中，行H

3、E染色，光鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化情況，并進(jìn)行肺病理評(píng)分。取出完整的右肺組織用紙巾迅速拭干肺表面的血液及水分，放置于電子天平秤上測(cè)量濕/干（W/D）質(zhì)量比值；檢測(cè)血漿TNF-α和IL-1β、IL-6濃度變化情況。
　　2.觀察不同劑量的鹽酸右美托咪定對(duì)大鼠高氧急性肺損傷的作用是否具有劑量依賴(lài)性。建立大鼠高氧急性肺損傷模型，將動(dòng)脈血?dú)夥治?、肺組織病理學(xué)檢查、肺細(xì)胞早期凋亡率作為評(píng)判指標(biāo)，討論不同劑量的鹽酸右美托咪定對(duì)大鼠高氧急性肺損

4、傷的作用是否有劑量依賴(lài)性。將80只健康SD大鼠隨機(jī)分為4組，即高氧肺損傷（HALI）組即(H組)、鹽酸右美托咪定2.5μg/(kg·h)組（DL）、鹽酸右美托咪定5μg/(kg·h)組（DM）、鹽酸右美托咪定10μg/(kg·h)組（DH），4組大鼠分別置于高氧箱中喂養(yǎng)48h后取標(biāo)本檢測(cè)。DL組給予右美托咪定2.5μg/(kg·h)，加入到20ml5%葡萄糖注射液中，0.5ml/h，尾靜脈持續(xù)泵入，立刻入高氧箱；DM組給予右美托咪定5μ

5、g/(kg·h)，加入到20ml5%葡萄糖注射液中，0.5ml/h，尾靜脈持續(xù)泵入，立刻入高氧箱；DH組給予右美托咪定10μg/(kg·h)加入20ml5%葡萄糖注射液中，0.5ml/h，尾靜脈持續(xù)泵入，立刻入高氧箱；H組給予等量的糖水，尾靜脈持續(xù)泵入，立刻入高氧箱。48h后造模結(jié)束，把各組大鼠從箱中取出，分別麻醉，逐一取頸動(dòng)脈血，行血?dú)夥治?，分別計(jì)算氧合指數(shù)(OI)、呼吸指數(shù)(RI)；將左下肺組織置于10%福爾馬林標(biāo)本固定液中，行HE

6、染色，光鏡下觀察肺組織病理變化情況，并做肺病理評(píng)分；取右肺組織用流式細(xì)胞儀檢測(cè)法檢測(cè)肺細(xì)胞早期凋亡率。
　　3. PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路在右美托咪定對(duì)大鼠高氧急性肺損傷的作用。將80只健康SD大鼠隨機(jī)分為4組，即：高氧肺損傷(HALI)組即(H組)、DM（右美托咪定）組、WD（渥曼青霉素+右美托咪定）組、W（渥曼青霉素）組，將4組大鼠分別置于高氧箱中喂養(yǎng)。DM組給予右美托咪定5μg/(kg·h)，加入20ml5%葡萄糖注射液

7、中，0.5ml/h，尾靜脈持續(xù)泵入，立刻入高氧箱；WD組給予渥曼青霉素+右美托咪定，入高氧箱前先尾靜脈緩慢注射渥曼青霉素30μg/kg，后將右美托咪定5μg/(kg.h)加入到20ml5%葡萄糖注射液，0.5ml/h，尾靜脈持續(xù)泵入，立刻入高氧箱。W組先給于30μg/kg的渥曼青霉素，尾靜脈緩慢注射，后給予等量的5%葡萄糖注射液，0.5ml/h，尾靜脈持續(xù)泵入，立刻入高氧箱。H組給予等量、等速度的5%葡萄糖注射液，尾靜脈持續(xù)泵入，立刻后

8、入高氧箱。48h后造模結(jié)束，將各組大鼠取出，分別麻醉處死，打開(kāi)胸腔，分別取出左右肺組織。將左肺放置于10%福爾馬林標(biāo)本固定液中，行HE染色，光鏡下觀察各組大鼠肺病理變化情況，并進(jìn)行肺病理評(píng)分，將右肺用western blotting法檢測(cè)PI3K、AKT、P-Akt、GSK-3β、P-GSK-3β蛋白表達(dá)量。
　　結(jié)果：
　　1.
　　（1）肺組織大體觀察結(jié)果
　　空氣組，肺組織顏色均勻，呈粉紅色，未見(jiàn)出血點(diǎn)、組

9、織水腫及壞死表現(xiàn)，用手觸摸肺組織較柔軟有彈性。高氧組24h肺組織呈淡紅色，表面有極少量的、散在的，大小不等的點(diǎn)狀出血;高氧48h肺組織略顯暗紅，充血較明顯，略顯水腫，伴有少量的點(diǎn)狀或小片狀出血點(diǎn)；高氧72h肺組織損傷較嚴(yán)重，呈暗紅色，肺組織明顯水腫，肺表面可見(jiàn)多處斑片狀出血，個(gè)別損傷嚴(yán)重的，胸腔可見(jiàn)透亮的或淡紅色的胸腔積液，甚至口鼻處出現(xiàn)血性分泌物。
　?。?）肺組織HE染色結(jié)果及肺病理評(píng)分
　　空氣組肺泡結(jié)構(gòu)清晰完整，肺泡

10、大小均勻，肺泡壁光滑，肺泡腔內(nèi)未見(jiàn)白細(xì)胞及滲出物，肺泡間隔無(wú)增寬，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；高氧組24h肺泡結(jié)構(gòu)較清晰，肺泡腔內(nèi)有少量滲出液伴有少量紅細(xì)胞漏出，極少數(shù)有毛細(xì)血管擴(kuò)張，肺泡間隔稍增厚；高氧48h肺泡腔內(nèi)滲出液明顯增多，有部分紅細(xì)胞漏出，肺組織毛細(xì)血管擴(kuò)張明顯，少數(shù)肺泡腔變大，肺泡間隔明顯增厚，多數(shù)肺泡間隔斷裂伴有大量WBC滲出；高氧組72h大鼠肺組織彌漫性損傷，肺組織結(jié)構(gòu)顯示不清，肺泡壁斷裂融合成肺大泡；肺泡腔及肺間質(zhì)內(nèi)充滿(mǎn)WBC，

11、伴水腫，嚴(yán)重者有透明膜形成。各組肺組織病理學(xué)評(píng)分比較，DL、DM組與H組比較病理評(píng)分降低(P<0.05），DM組與DL組比較肺病理評(píng)分降低差異顯著(P<0.05)，DH組與H組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　（3）血?dú)夥治?br>　　空氣組氧合指數(shù)(OI)無(wú)明顯變化（P>0.05），高氧組隨高氧暴露時(shí)間延長(zhǎng)OI逐漸降低與空氣組比較（P<0.05）；空氣組RI無(wú)明顯變化（P>0.05），高氧組隨高氧暴露時(shí)間延長(zhǎng)RI逐漸升

12、高（P<0.05）。
　?。?）血漿炎性因子
　　空氣組隨時(shí)間延長(zhǎng)血漿IL-1β、IL-6、TNF-α濃度無(wú)明顯改變（P>0.05），高氧組隨時(shí)間延長(zhǎng)IL-β、IL-6、TNF-α濃度逐漸升高（P<0.05）。
　?。?）肺組織W/D比值
　　空氣組肺組織W/D無(wú)明顯變化（P>0.05），高氧組隨時(shí)間延長(zhǎng)肺組織W/D比值逐漸升高（P<0.05）。
　　2.
　?。?）肺組織細(xì)胞早期凋亡率
　　D

13、L、DM組與H組比較，肺組織早期凋亡率均有降低(P<0.05)，但DM組與DL組比較早期凋亡率降低差異顯著(P<0.05)，DH組與H組比較肺組織細(xì)胞早期凋亡率無(wú)明顯差異（P>0.05），DM與DH組比較肺組織細(xì)胞早期凋亡率降低差異顯著(P<0.05)。去掉超安全劑量DH組后呈線性變化趨勢(shì)（P<0.05）。
　?。?）肺組織病理學(xué)變化與肺病理學(xué)評(píng)分
　　H組肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡壁明顯增厚，個(gè)別肺泡壁斷裂，部分融合成肺大泡，肺泡

14、間隔明顯水腫、增寬、可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞滲出；DH組肺組織結(jié)構(gòu)稍紊亂，部分肺泡壁斷裂，并融合成肺大泡，肺泡間隔有明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，表現(xiàn)同H組；DM組肺泡結(jié)構(gòu)較清晰，肺組織少許充血水腫，呈暗紅色，肺表面有少量點(diǎn)狀出血，肺泡間隔有極少數(shù)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。各組肺組織病理學(xué)評(píng)分和病理學(xué)變化結(jié)果趨勢(shì)一致。DL、DM組與H組比較(P<0.05)；DH組與H組比較(P>0.05)，DM組與DH組比較差異顯著(P<0.05)。去掉超安全劑量DH組后呈線性變化

15、趨勢(shì)。
　?。?）血?dú)夥治?br>　　DL、DM組與H組RI比較（P>0.05）；DL、DM組與H組OI比較(P<0.05)。去掉超安全劑量DH組后呈線性變化趨勢(shì)（P<0.05）。
　　3.
　?。?）肺組織肺病理學(xué)變化與肺病理評(píng)分
　　H組肺泡組織損傷面積廣泛，個(gè)別肺泡結(jié)構(gòu)顯示不清，肺泡腔及肺間質(zhì)內(nèi)充滿(mǎn)大量白細(xì)胞，伴透明膜形成。DM組擴(kuò)張的肺毛細(xì)血管內(nèi)充血，伴隨白細(xì)胞粘附，肺泡腔內(nèi)有滲出液和大量紅細(xì)胞漏出。部分

16、肺泡間隔增厚伴有肺泡間隔斷裂，周?chē)写罅堪准?xì)胞聚集呈滲出改變。WD組病理學(xué)改變同H組。各組肺病理評(píng)分和肺病理學(xué)變化趨勢(shì)一致。使用和未使用右美托咪定的效果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），使用和未使用渥曼青霉素的效果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），且二者存在交互作用，即渥曼青霉素能夠影響右美托咪定藥物作用效果（P<0.05）。
　　（2）蛋白印跡結(jié)果
　　在PI3KP110、p-AKT和p-GSK-3β的表達(dá)中，以右美托咪定為主效應(yīng)

17、結(jié)果提示P<0.05，使用與未用右美托咪定的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。渥曼青霉素主效應(yīng)結(jié)果提示P<0.05，使用與未用渥曼青霉素的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；二者交互效應(yīng)結(jié)果提示P<0.05，即二者存在交互作用。
　　在PI3KP85、AKT和GSK-3β的表達(dá)中，以右美托咪定為主效應(yīng)結(jié)果提示P>0.05，使用與未用右美托咪定的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；渥曼青霉素主效應(yīng)結(jié)果提示P>0.05，使用與未用渥曼青霉素的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；二者交互效應(yīng)結(jié)果提示P>0