球孢白僵菌高毒力菌株的篩選及其與小菜蛾互作相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄組分析.pdf

1、小菜蛾（Plutella xylostella）是一種世界性害蟲(chóng)，主要危害十字花科植物。不僅危害嚴(yán)重，而且由于化學(xué)農(nóng)藥的大量使用，已發(fā)現(xiàn)該蟲(chóng)對(duì)多種化學(xué)農(nóng)藥產(chǎn)生了較強(qiáng)的抗藥性。開(kāi)發(fā)新型有效的生物農(nóng)藥是解決當(dāng)前小菜蛾防治難題的有效途徑之一。球孢白僵菌（Beauveria bassiana）是當(dāng)前研究和應(yīng)用最廣泛的真菌類(lèi)生物農(nóng)藥之一，篩選對(duì)小菜蛾具有高毒力的球孢白僵菌菌株，并分析球孢白僵菌與小菜蛾之間的互作相關(guān)基因，是進(jìn)一步提高球孢白僵菌對(duì)小

2、菜蛾防治效果的重要基礎(chǔ)。
　　本研究首先通過(guò)對(duì)不同地區(qū)采集的球孢白僵菌菌株進(jìn)行初步篩選，獲得對(duì)小菜蛾致病力最強(qiáng)的高毒力菌株。其次，以此高毒力菌株為研究對(duì)象，將純培養(yǎng)的球孢白僵菌、未受感染的小菜蛾幼蟲(chóng)和球孢白僵菌侵染小菜蛾48h的蟲(chóng)菌混合樣品分別進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，篩選侵染及致病過(guò)程中真菌和昆蟲(chóng)差異表達(dá)的基因，并分析相關(guān)基因的功能，探討球孢白僵菌與小菜蛾之間互作的相關(guān)基因，為球孢白僵菌菌株的基因改良奠定基礎(chǔ)。
　　主要研究結(jié)果如下

3、:
　　1.球孢白僵菌對(duì)小菜蛾高毒力菌株的篩選:
　　選擇分離自鱗翅目昆蟲(chóng)的球孢白僵菌菌株20株，對(duì)小菜蛾2齡幼蟲(chóng)進(jìn)行生物測(cè)定，初步篩選出對(duì)小菜蛾2齡幼蟲(chóng)毒力較強(qiáng)的菌株5株為Bb2393、Bb2391、Bb2361、Bb2356、Bb2345。進(jìn)一步不同濃度孢子懸浮液生物測(cè)定結(jié)果表明5株菌株的半致死時(shí)間分別為4.59d、5.17d、5.38d、5.3d、5.5d，半致死濃度為1.48×105孢子/mL、3.10×105孢子/

4、mL、6.18×105孢子/mL、6.95×105孢子/mL、1.27×106孢子/mL。不同溫度條件下生物測(cè)定結(jié)果表明:Bb2393溫度適應(yīng)性較強(qiáng)，在20℃和25℃兩個(gè)溫度條件下，25℃Bb2393的校正侵染率為88.69％，致死中時(shí)為4.32d。因此，篩選獲得的球孢白僵菌Bb2393菌株為防治小菜蛾的最適菌株。
　　2.球孢白僵菌侵染及致病相關(guān)基因分析:
　　轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示，純培養(yǎng)的球孢白僵菌與侵染小菜蛾幼蟲(chóng)48h的

5、球孢白僵菌轉(zhuǎn)錄組對(duì)比分析共得到8383個(gè)差異表達(dá)基因，其中顯著差異表達(dá)基因716個(gè)(FDR FDR≤0.001，log2Ratio≥1)，上調(diào)基因350個(gè)，下調(diào)基因366個(gè)。GO二級(jí)分類(lèi)表明，DEGs被注釋到26個(gè)GO term中，包括11個(gè)生物學(xué)過(guò)程(biological processes)，8個(gè)細(xì)胞組分(cellular component)和7個(gè)分子功能（molecular function）。pathway分析表明:共有12個(gè)

6、Pathway(Pvaluetion)，93個(gè)上調(diào)基因和61個(gè)下調(diào)基因參與了這些途徑。深入分析DEGs發(fā)現(xiàn)，類(lèi)幾丁質(zhì)蛋白(chitinase-like protein)、幾丁質(zhì)酶1(chitinase1)、酸性幾丁質(zhì)酶(acidic chitinase)、細(xì)胞壁半乳糖抗原蛋白(antigeniccell wall galactomannoprotein，putative)、胞外絲氨酸富集蛋白（extracellular serine-r

7、ich protein）等在侵染過(guò)程與毒力相關(guān)的基因均具有顯著性差異表達(dá)。另外我們還獲得了一些早期未見(jiàn)報(bào)道的可能與侵染相關(guān)的基因，這些基因在侵染過(guò)程中的作用有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。
　　3.小菜蛾對(duì)抗球孢白僵菌的免疫相關(guān)基因分析:
　　以小菜蛾為對(duì)照，感染球孢白僵菌48h小菜蛾為處理組，利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)分析其基因表達(dá)差異。通過(guò)分析得到15542個(gè)表達(dá)差異基因，其中顯著差異表達(dá)基因2434個(gè)（FDR≤0.001和log2Ratio

8、≥1），上調(diào)基因1080個(gè)，下調(diào)基因1354個(gè)。2434個(gè)基因?qū)儆谌齻€(gè)GO域（生物過(guò)程、細(xì)胞成分、分子功能）的45個(gè)不同功能組。KEGG結(jié)果顯示DEGs能夠匹配到298個(gè)代謝通路，其中富集較顯著的通路有25個(gè)(Pvalue≤0.05)。此外，還篩選到肽聚糖識(shí)別蛋白、酚氧化酶、絲氨酸蛋白酶等與免疫應(yīng)答相關(guān)的基因、海藻糖酶等與能量代謝相關(guān)的基因和次級(jí)代謝產(chǎn)物相關(guān)基因。這些小菜蛾對(duì)抗球孢白僵菌免疫相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)，為進(jìn)一步通過(guò)調(diào)控小菜蛾的免疫力