miR-450a-5p在漿液性卵巢癌中的表達及功能初步研究.pdf

1、上皮性卵巢癌是婦科最致命的惡性腫瘤，占所有卵巢癌75％~90%，其中漿液性卵巢癌又占全部上皮性卵巢癌的60%~70%。因早期階段的卵巢癌無明顯可察覺癥狀及體征，并且目前缺少有效的早期診斷及早期治療手段，故70％以上病人就診時已屬晚期，平均5年生存率低于30％，死亡率居所有女性生殖道癌癥的第一位。MicroRNAs(miRNAs)是內(nèi)源性非編碼小RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達，參與了正常細胞的增殖，細胞分化，細胞代謝及細胞凋亡等生物生

2、理進程，也與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。根據(jù)調(diào)控靶基因不同，miRNAs可作為抑癌基因或癌基因參與腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移、耐藥等病理進程。目前miRNAs與漿液性卵巢癌的研究也有報道，但作用機理尚不十分明確。目前國外研究人員認為，漿液性卵巢癌主要起源于輸卵管上皮，且以傘端多見。本實驗組前期以正常輸卵管傘端組織為對照，經(jīng)miRNA芯片篩選，發(fā)現(xiàn)miR-450a-5p在漿液性卵巢癌組織中表達量顯著下調(diào)，且其功能機制尚未在卵巢癌中研究報道。故本實驗組

3、選取miR-450a-5p為研究分子，以正常人輸卵管傘端為對照，通過初步科學(xué)研究，希望miR-450a-5p能成為早期診斷、治療及預(yù)防漿液性卵巢癌的重要生物學(xué)分子?；谇捌谛酒Y(jié)果，本實驗組擬：(1)應(yīng)用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測大樣本中miR-450a-5p的表達差異情況，并分析miR-450a-5p各組表達水平和漿液性卵巢癌臨床病理特征之間的相關(guān)性；(2)通過轉(zhuǎn)染miR-450a-5p mimics構(gòu)建過表達miR

4、-450a-5p的漿液性卵巢癌SKOV3細胞系，通過細胞功能學(xué)實驗研究過表達的miR-450a-5p對SKOV3細胞系腫瘤生物學(xué)行為的影響；(3)通過免疫印跡實驗（western blot）及雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灒╠ual-luciferase reporter gene assay）驗證miR-450a-5p的靶基因及調(diào)控漿液性卵巢癌發(fā)生發(fā)展的可能分子信號通路機制，為臨床治療卵巢癌提供新的理論依據(jù)。
　　目的：
　　1.

5、檢測miR-450a-5p在漿液性卵巢癌中的表達情況，并分析miR-450a-5p的表達與漿液性卵巢癌臨床病理特征之間的關(guān)系。
　　2.研究miR-450a-5p對人漿液性卵巢癌SKOV3細胞的增殖、遷移、侵襲、周期、凋亡腫瘤生物學(xué)行為的影響。驗證miR-450a-5p的靶基因，探討其在漿液性卵巢癌中發(fā)生發(fā)展的作用機制。
　　方法：
　　1.選取101例漿液性卵巢癌石蠟包埋組織及50例正常輸卵管傘端石蠟包埋組織。所有樣

6、本的選取均由2位資深病理專家判讀完成。
　　2.用qRT-PCR技術(shù)驗證芯片結(jié)果，并分析miR-450a-5p表達水平和臨床病理特征分組之間相關(guān)性。
　　3.用miR-450a-5p mimics轉(zhuǎn)染人漿液性卵巢癌 SKOV3細胞，構(gòu)建過表達miR-450a-5p的細胞系，并設(shè)陰性對照組(NC)及空白對照組(Blank)，通過MTT實驗檢測細胞增殖能力、Transwell遷移實驗和劃痕實驗檢測細胞遷移能力、Transwell

7、侵襲實驗檢測細胞侵襲能力、流式細胞術(shù)檢測細胞周期及凋亡。
　　4.使用生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-450a-5p可能調(diào)控的靶基因，查閱相關(guān)文獻，選定靶基因。
　　5.用western blot及dual-luciferase reporter gene assay驗證miR-450a-5p可能的靶基因。
　　6.結(jié)果采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，獨立樣本的t檢驗，P<0.05差異認為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)

8、果：
　　1. MiR-450a-5p在漿液性卵巢癌組織中的表達水平顯著低于正常輸卵管傘端組織。
　　2. MiR-450a-5p的表達水平與漿液性卵巢癌臨床病理特征之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　3. MTT實驗：過表達miR-450a-5p組細胞增殖活力與NC組、blank組無明顯差異，提示了miR-450a-5p對SKOV3細胞系的增殖活力無明顯影響。Transwell遷移及侵襲實驗均顯示轉(zhuǎn)染miR-450a-5p

9、 mimics后，細胞的遷移及侵襲能力明顯減弱，提示過表達的miR-450a-5p不僅抑制了SKOV3細胞系的遷移能力，對其侵襲能力也有抑制。細胞劃痕實驗：MiR-450a-5p mimics組細胞遷移能力較NC組、blank組降低，提示過表達的miR-450a-5p抑制了SKOV3細胞系的遷移能力。流式細胞術(shù)：過表達miR-450a-5p后，mimics組細胞周期明顯被阻滯于G1期MiR-450a-5p mimics組、NC組、bla

10、nk組凋亡結(jié)果無明顯差異。
　　4.通過生物學(xué)軟件預(yù)測miR-450a-5p靶基因并結(jié)合相關(guān)文獻，分析DUSP10可能為miR-450a-5p的靶基因。
　　5.通過western blot實驗發(fā)現(xiàn)miR-450a-5p mimics組DUSP10蛋白表達水平顯著性降低；Dual-luciferase reporter gene assay實驗提示miR-450a-5p的靶基因為DUSP10。
　　結(jié)論：
　　1

11、.以正常輸卵管傘端為對照，經(jīng)大樣本驗證，miR-450a-5p在漿液性卵巢癌中呈顯著性低表達，提示miR-450a-5p可能參與了漿液性卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展。
　　2.過表達漿液性卵巢癌SKOV3細胞系miR-450a-5p后，可降低SKOV3細胞侵襲及遷移能力，并將細胞周期阻滯于G1期。
　　3.MiR-450a-5p靶基因可能為DUSP10，通過miR-450a-5p/DUSP10/MAPKs通路調(diào)節(jié)漿液性卵巢癌進展。