鴨瘟病毒CHv株UL54基因及其編碼蛋白特性與基本功能研究.pdf

1、口’、_!，崩拳g翳&墅8璺疊⑧熬筻凝譬學蟹墮墊按2女鯉博士學位論文■■■毒CHv株UL54基因及箕■碼疊白特性與基本功能研究2017隼05月pU川農業(yè)人學博I：學位論文摘要鴨瘟病毒(duckplaguevirusDPV)屬于皰疹病毒科、0【皰疹病毒亞科、馬立克氏病毒屬，其感染鴨、鵝等水禽，常造成嚴重的發(fā)病和死亡。與其它皰疹病毒相比，DPV分子生物學研究起步較晚，但發(fā)展迅速，目前多數(shù)基因的研究『F在進行，而UL54基因及其編碼蛋白在DP

2、V致病過程中的具體作用尚屬未知。因此本論文的主要目的是希望通過分析DPVUL54基因及其編碼蛋白的特性與基本功能，幫助闡明DPV的致病機理。論文首先對DPVUL54基因進行生物信息學分析和多克隆抗體制各，并分別用實時熒光定量PCR和免疫印跡分析轉錄時kH幣u表達時相；其次用間接免疫熒光法對UL54蛋白進行細胞內定位分析；然后采用種問異核體技術解析UL54蛋白的核質穿梭活性及其功能區(qū)；接著構建基于BAC的UL54基因缺失株和回復株并評價其

3、基本生物學特性(包括生長曲線、空斑形成和病毒基因組DNA拷貝數(shù))；隨后用實時熒光定量PCR分析UL54調控DPV其他基因的表達，并且分別基于核runoff試驗、直接熒光原位雜交試驗和核糖體一新生肽鏈復合物(RNC)，研究UL54在DPV基因轉錄、mRNA出核、翻譯過程中的作用；最后通過DAPI染核、HE染色、AnnexinVFITC／PI雙染流式檢測、Caspase3相對表達水平和活性檢測，研究DPVUL54對DEF細胞凋亡的影響。結果

4、表明：①DPVUL54基因包含的完整ORF大小為1377bp，編碼肽鏈由458個氨基酸組成，該肽鏈無信號肽和跨膜區(qū)，包含18個抗原表位；其密碼子使用模式與大腸桿菌接近，除了編碼Met、Glu和Trp的密碼子外，其他氨基酸的密碼子使用都存在偏嗜性，且第三位偏向使用～T；UL54蛋白被預測出主要定位于細胞核，且包含1個核輸出信號(NES)和多個核定位信號(NLS)；②DPVUL54屬于立即早期基因，編碼蛋白分子量約570KDa；在病毒感染0

5、5／2h后能檢測到，24h達到峰值；轉錄與表達的動態(tài)變化基本一致；③DPVUL54蛋白在28h主要定位于細胞質，1236h逐漸進行細胞核，48h完全入核，60h后少量出現(xiàn)在細胞質；④DPVUL54蛋白具有核質穿梭活性；包含功能性NES，其對萊普霉素B(LMB)敏感，且對UL54蛋白自身定位沒有顯著影響；包含多個功能性NLS，其聯(lián)合作用影響UL54蛋白自身定位；UL54蛋白入核對病毒復制、空斑形成、病毒基因組DNA復制和各時期病毒基因mR

6、NA表達都有重要作用；⑤DPVUL54不是病毒復制必需的，但能促進病毒增殖、空斑形成和病毒基因組DNA復制；⑥DPVUL54正負雙向調控ULl9、UL30、UL48、gC、gD和gK基因mRNA表達：對ULl9mRNA的調控以抑制為主；始終促進UL30和gC基因mRNA表達；對UL48和gD基因mRNA是早期抑制，中后期促進；對gK基因mRNA在感染早中期有促進或抑制作用；⑦DPVUL54早期抑制UL30基因的轉錄，始終促進其他時期的U