西洋參通過(guò)調(diào)節(jié)Nrf2抑制主動(dòng)脈弓縮窄術(shù)誘導(dǎo)的小鼠心室重構(gòu)的研究.pdf

1、背景
　　 據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)預(yù)測(cè)，在2020年心血管疾病將會(huì)成為世界上死亡率最高的疾病。心力衰竭是多種心血管疾病的最終結(jié)局，心室重構(gòu)被認(rèn)為是導(dǎo)致心力衰竭及其病情惡化的內(nèi)在原因。當(dāng)應(yīng)激長(zhǎng)期存在時(shí)，持續(xù)性心肌肥大發(fā)生失代償，從而導(dǎo)致心律失常，心力衰竭和猝死。心室重構(gòu)的主要病理變化包括心室腔的異常擴(kuò)張，心臟重量增加，心肌細(xì)胞肥大和凋亡，心肌間質(zhì)纖維化和胚胎基因異常表達(dá)等。盡管目前的藥物方面有了很大的進(jìn)展，但由于全世界范圍內(nèi)心力

2、衰竭導(dǎo)致的死亡率和致殘率依然很高，所以有必要針對(duì)改善心室重構(gòu)尋找新的治療靶點(diǎn)。
　　 1956年，DenhamHarman首次提出“自由基理論”，認(rèn)為內(nèi)源性自由基生成過(guò)多，可造成細(xì)胞內(nèi)DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和細(xì)胞元件的累積損傷。然而，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)自由基及其衍生物有利的生物學(xué)效應(yīng)。因此，自由基是一把“雙刃劍”，其生成和清除的動(dòng)態(tài)平衡維持著內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。當(dāng)自由基生成過(guò)多或清除過(guò)慢，超過(guò)細(xì)胞內(nèi)的抗氧化能力時(shí)，就會(huì)發(fā)生氧化應(yīng)激，從而

3、導(dǎo)致氧化損傷和疾病的發(fā)生。研究表明，氧化應(yīng)激是導(dǎo)致心血管結(jié)構(gòu)功能異常的重要原因之一，與動(dòng)脈粥樣硬化、心肌肥厚和心力衰竭等疾病關(guān)系密切。雖然氧化應(yīng)激損傷是許多疾病發(fā)生的基礎(chǔ)，但適度的氧化應(yīng)激也會(huì)同時(shí)啟動(dòng)機(jī)體產(chǎn)生內(nèi)源性的保護(hù)作用。外源性過(guò)度清除自由基不僅抑制其正常的生理作用，也導(dǎo)致體內(nèi)氧化-抗氧化系統(tǒng)的紊亂。因此，調(diào)節(jié)內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)逐漸成為治療心血管疾病的研究熱點(diǎn)，但確切的治療靶點(diǎn)及其分子機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。
　　 NF-E2-r

4、elatedfactors(Nrfs)是啟動(dòng)內(nèi)源性抗氧化反應(yīng)元件的轉(zhuǎn)錄因子，屬于有亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)的Cap'n'Collar(CNC)轉(zhuǎn)錄因子家族，該家族成員主要包括NF-E2、Nrfs和Bach1-2。Nrfs有Nrf1、Nrf2、Nrf3三個(gè)亞型，Nrf2是其中活性最強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。目前關(guān)于Nrf2的激活機(jī)制尚未完全闡明，其中，Nrf2-Keap1復(fù)合體的解離是Nrf2活化的主要方式之一。此外，調(diào)節(jié)Nrf2活性的其它途徑，如磷酸化、

5、競(jìng)爭(zhēng)性抑制和轉(zhuǎn)錄后修飾等機(jī)制仍在研究中。Nrf2在心血管系統(tǒng)中表達(dá)廣泛，大量研究表明，Nrf2與動(dòng)脈粥樣硬化、心肌缺血再灌注損傷和高血壓等疾病密切相關(guān)。Nrf2通過(guò)調(diào)節(jié)抗氧化基因的表達(dá)促進(jìn)氧化還原的平衡，是多種心血管疾病的重要調(diào)節(jié)因子。
　　 中醫(yī)理論認(rèn)為，人體各種生理病理變化都是陰陽(yáng)變化的結(jié)果，陰陽(yáng)失衡標(biāo)志著疾病的產(chǎn)生。傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)中雖未見(jiàn)“氧化應(yīng)激”的明確概念，但中醫(yī)理論的基礎(chǔ)與核心——陰陽(yáng)學(xué)說(shuō)，與氧化應(yīng)激理論有許多共同點(diǎn)。例

6、如，二者的平衡都不是一成不變的，而是一種動(dòng)態(tài)的平衡;一旦動(dòng)態(tài)平衡遭到破壞，就會(huì)導(dǎo)致衰老或疾病發(fā)生;陰和陽(yáng)，氧化和還原，雙方相互依存，互為根本;二者均從不同角度反應(yīng)了維持人體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要性。盡管如此，陰和陽(yáng)是對(duì)事物或現(xiàn)象某一屬性的概括，中醫(yī)陰陽(yáng)平衡學(xué)說(shuō)無(wú)法等同于氧化應(yīng)激理論，二者之間的聯(lián)系還需進(jìn)一步探討。
　　 為研究抗氧化應(yīng)激因子Nrf2在心室重構(gòu)中的作用，本實(shí)驗(yàn)利用Nrf2敲基因和轉(zhuǎn)基因小鼠，通過(guò)縮窄主動(dòng)脈弓(TAC)建立

7、小鼠壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心室重構(gòu)動(dòng)物模型，觀察Nrf2對(duì)心室重構(gòu)的保護(hù)作用，并探討其可能的機(jī)制。
　　 目的
　　 (1)分別觀察Nrf2轉(zhuǎn)基因小鼠和Nrf2敲基因小鼠TAC術(shù)后的心室重構(gòu)情況;
　　 (2)探討Nrf2對(duì)心室重構(gòu)的作用機(jī)制。
　　 方法
　　 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組
　　 Nrf2敲基因小鼠，品系為ICR/Sv129，52只8-9周齡的雄性Nrf2+/+和Nrf2-/-小鼠被納入

8、實(shí)驗(yàn)，分為Nrf2+/+假手術(shù)組（13只），Nrf2+/+TAC組（13只），Nrf2-/-假手術(shù)組（13只）和Nrf2-/-TAC組（13只）。
　　 Nrf2轉(zhuǎn)基因小鼠，品系為FVB/NJ，44只8-10周齡的雄性小鼠被納入實(shí)驗(yàn)，分為Nrf2wt假手術(shù)組（11只），Nrf2wtTAC組（11只），Nrf2tg假手術(shù)組（11只）和Nrf2tgTAC組（11只）。
　　 2.小鼠基因型鑒定
　　 異氟烷麻醉小鼠后

9、，給小鼠耳朵打孔及剪尾，用DNA提取試劑盒提取出小鼠尾巴的DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增和凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。
　　 3.小鼠超聲檢測(cè)
　　 Nrf2敲基因小鼠:分別在小鼠8-9周齡，建立TAC模型后第7天，第14天，第21天和第28天進(jìn)行心功能的超聲檢測(cè)。
　　 Nrf2轉(zhuǎn)基因小鼠:分別在小鼠8-10周齡，建立TAC模型后第7天，第14天和第28天進(jìn)行心功能的超聲檢測(cè)。
　　 選用RMV707B探頭，頻率設(shè)

10、置為37.5MHz，探頭置于小鼠左側(cè)胸前，2D超聲示左室短軸切面，在乳頭肌水平應(yīng)用M模式超聲記錄左心室運(yùn)動(dòng)情況，測(cè)量心率(HR)、舒張期左室內(nèi)徑(LVIDd)，收縮期左室內(nèi)徑(LVIDs)和舒張期左室前壁厚度(LVPWd)，根據(jù)以下公式計(jì)算左室短軸縮短率(LVFS):LVFS=[(LVIDd-LVIDs)/LVIDd]×100％
　　 4.建立小鼠TAC模型
　　 手術(shù)組小鼠用異氟烷麻醉后，剪開(kāi)小鼠頸部和胸部皮膚，手術(shù)顯

11、微鏡下從胸骨切際剪至胸骨角上緣，暴露主動(dòng)脈弓。將帶針的7-0縫線穿過(guò)主動(dòng)脈弓，放置27號(hào)針頭，打結(jié)后去除針頭，造成主動(dòng)脈弓狹窄，逐層關(guān)閉。假手術(shù)組除了不進(jìn)行主動(dòng)脈縮窄外，其余手術(shù)程序完全與模型組相同。
　　 5.標(biāo)本留取
　　 TAC術(shù)后4周，處死小鼠。灌注后，迅速取下心臟和肺，分別稱(chēng)重。分離左腿脛骨，測(cè)量長(zhǎng)度。
　　 6.病理染色
　　 留取心臟標(biāo)本，進(jìn)行Masson染色、WGA染色。
　　 7

12、.免疫組織化學(xué)染色
　　 留取心臟標(biāo)本，進(jìn)行TUNEL染色、4-HNE和8-OHdG免疫熒光染色。
　　 8.Real-timeRT-PCR
　　 檢測(cè)左心室組織中的ANF、BNP、α-MHC、β-MHC、SERCA2a、NQO-1、HO-1、Txn-1和Txnrd-1mRNA表達(dá)水平，并以管家基因GAPDH作為參照。
　　 10.統(tǒng)計(jì)分析
　　 除標(biāo)注外，所有數(shù)據(jù)用x±SD表示，組內(nèi)組間差異比較

13、采用單因素方差分析。應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理(Version16.0;SPSSInc)，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)果
　　 1.實(shí)驗(yàn)小鼠的基因型鑒定
　　 在Nrf2敲基因小鼠的電泳結(jié)果中，只有700bp條帶的為Nrf2+/+小鼠，只有400bp條帶的為Nrf2-/-小鼠，有700bp和400bp兩條帶的為Nrf2+/-小鼠。
　　 在Nrf2轉(zhuǎn)基因小鼠的電泳結(jié)果中，在1058bp處有

14、條帶的為Nrf2tg小鼠，沒(méi)有條帶的為Nrf2wt小鼠。
　　 2.實(shí)驗(yàn)小鼠的基本情況
　　 在Nrf2敲基因小鼠中，假手術(shù)組術(shù)后無(wú)小鼠死亡。TAC術(shù)后，Nrf2+/+小鼠的存活率為84.62％(11/13)，而Nrf2-/-小鼠的存活率為76.92％(10/13)，存活率降低。最終完成實(shí)驗(yàn)的小鼠共47只，其中Nrf2+/+假手術(shù)組13只，Nrf2+/+TAC組11只，Nrf2-/-假手術(shù)組13只和Nrf2-/-TAC組

15、10只。術(shù)后小鼠體重各組間均無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 在Nrf2轉(zhuǎn)基因小鼠中，假手術(shù)組術(shù)后無(wú)小鼠死亡。TAC術(shù)后，Nrf2wt小鼠的存活率為72.73％(8/11)，而Nrf2tg小鼠的存活率為81.82％(9/11)，高于野生型小鼠。最終完成實(shí)驗(yàn)的小鼠共39只，其中Nrf2wt假手術(shù)組11只，Nrf2wtTAC組8只，Nrf2tg假手術(shù)組11只和Nrf2tgTAC組9只。術(shù)后小鼠體重各組間均無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 3

16、.實(shí)驗(yàn)小鼠的心功能變化
　　 在Nrf2敲基因小鼠中，與假手術(shù)組相比，TAC術(shù)后14天，Nrf2-/-TAC組和Nrf2+/+TAC組小鼠的LVIDs和LVPWd均增厚，LVFS降低，說(shuō)明TAC術(shù)誘導(dǎo)小鼠心臟肥大，心肌舒縮功能受到抑制。到28天時(shí)，Nrf2-/-TAC組小鼠的心功能較Nrf2+/+TAC組小鼠下降更為明顯，二者存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。假手術(shù)組小鼠心功能穩(wěn)定，手術(shù)前后和各組間無(wú)顯著差異。
　　 在Nrf2轉(zhuǎn)基因小鼠

17、中，TAC術(shù)后14天，Nrf2wt和Nrf2tg小鼠的LVIDd、LVIDs和LVPWd均比其對(duì)應(yīng)的假手術(shù)組增厚，LVFS降低，但Nrf2tgTAC組小鼠中的LVIDd、LVIDs和LVPWd和其假手術(shù)組相比，沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明Nrf2過(guò)表達(dá)可延緩壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心室重構(gòu)的進(jìn)程。第28天時(shí)，Nrf2wtTAC組和Nrf2tgTAC組小鼠心臟進(jìn)一步肥大，心肌舒縮功能明顯受到抑制，與假手術(shù)組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而在TAC組中，Nrf2tg小

18、鼠的LVFS高于Nrf2wt小鼠，表明Nrf2可改善壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的小鼠心功能受損。
　　 4.實(shí)驗(yàn)小鼠心肺重量及心肌大小的變化
　　 在Nrf2敲基因小鼠中，假手術(shù)后Nrf2+/+和Nrf2-/-兩組小鼠間在心臟大小、心肺重量及心肌大小上無(wú)差異，TAC術(shù)后4周，由于心臟后負(fù)荷增加，心臟代償性肥大。Nrf2-/-TAC組小鼠的心臟大小、心臟重量、肺重量和心肌細(xì)胞的面積均明顯大于Nrf2+/+TAC組小鼠，二者間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

19、，表明Nrf2-/-小鼠心功能比Nrf2+/+小鼠受損嚴(yán)重。
　　 在Nrf2轉(zhuǎn)基因小鼠中，TAC術(shù)后4周，Nrf2wt小鼠和Nrf2tg小鼠心臟均代償性肥大，但Nrf2wtTAC組小鼠心臟肥大的更為明顯，且其心臟重量、肺重量和心肌細(xì)胞的面積也明顯大于Nrf2tgTAC組小鼠，而假手術(shù)組兩種小鼠間未見(jiàn)明顯差異，表明Nrf2過(guò)表達(dá)可抑制壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥大。
　　 5.實(shí)驗(yàn)小鼠的心肌纖維化情況
　　 在Nrf2敲

20、基因小鼠中，Masson染色后，假手術(shù)組左心室膠原組織染色均為陰性。TAC術(shù)后4周，Nrf2+/+TAC組小鼠左心室纖維化的面積為13.05％，而Nrf2-/-TAC組小鼠左心室纖維化面積為22.34％，明顯高于野生型小鼠，室間隔纖維化情況亦是如此。這表明Nrf2敲除促進(jìn)了壓力負(fù)荷引起的心肌纖維化。
　　 在Nrf2轉(zhuǎn)基因小鼠中，TAC術(shù)后4周，小鼠心臟取材并進(jìn)行Masson染色。Nrf2wtTAC組小鼠左心室纖維化的面積為11

21、.89％，而Nrf2tgTAC組小鼠左心室纖維化面積為8.96％，低于野生型小鼠，二者間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。然而二者的室間隔和右心室的纖維化情況沒(méi)有差異。這表明Nrf2過(guò)表達(dá)能抑制TAC模型引起的左心室心肌纖維化。
　　 6.實(shí)驗(yàn)小鼠的心肌細(xì)胞凋亡情況
　　 在Nrf2敲基因小鼠中，TAC術(shù)后4周，心肌細(xì)胞凋亡增多。在Nrf2+/+小鼠中，TAC組小鼠心肌細(xì)胞的凋亡數(shù)是假手術(shù)組的10倍，而Nrf2-/-小鼠TAC術(shù)后心肌細(xì)胞的

22、凋亡數(shù)是假手術(shù)組的14倍，明顯高于Nrf2+/+小鼠。這表明Nrf2敲除促進(jìn)了壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。
　　 在Nrf2轉(zhuǎn)基因小鼠中，與假手術(shù)組相比，TAC術(shù)后4周，Nrf2wt小鼠和Nrf2tg小鼠的心肌細(xì)胞凋亡數(shù)均明顯增加。但TAC組中，兩種小鼠之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這表明Nrf2過(guò)表達(dá)不能抑制小鼠心臟后負(fù)荷增加誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。
　　 7.Nrf2轉(zhuǎn)基因小鼠的心肌胚胎基因的表達(dá)
　　 在Nrf2wt小鼠

23、中，TAC術(shù)后，Nrf2wt小鼠的ANF，BNP和β-MHCmRNA表達(dá)升高，α-MHC和SERCA2amRNA水平降低，而術(shù)后的Nrf2tg小鼠的ANF，BNP，β-MHC和α-MHC，SERCA2a的表達(dá)比Nrf2wtTAC組小鼠分別有所降低和升高。表明Nrf2過(guò)表達(dá)可調(diào)節(jié)心肌α-MHC/β-MHC比值，抑制胚胎基因的表達(dá)，提高心肌細(xì)胞收縮力從而抗心室重構(gòu)。
　　 8.實(shí)驗(yàn)小鼠的心肌氧化應(yīng)激情況
　　 在Nrf2敲基

24、因小鼠中，TAC模型導(dǎo)致Nrf2+/+和Nrf2-/-小鼠心臟4-HNE和8-OHdG的表達(dá)升高，同時(shí)，與Nrf2+/+TAC組小鼠相比，Nrf2-/-TAC組小鼠的4-HNE和8-OHdG的表達(dá)進(jìn)一步升高，氧化應(yīng)激損傷更為嚴(yán)重。這表明，Nrf2敲除能夠促進(jìn)病理性壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌氧化應(yīng)激損傷。
　　 在Nrf2轉(zhuǎn)基因小鼠中，假手術(shù)組的Nrf2wt和Nrf2tg小鼠心室4-HNE和8-OHdG表達(dá)極低，二組間無(wú)明顯差異。TAC術(shù)

25、后，與假手術(shù)組相比，Nrf2wt和Nrf2tg小鼠心臟左室4-HNE和8-OHdG表達(dá)均升高。同時(shí)，Nrf2tgTAC組小鼠的氧化應(yīng)激損傷水平低于Nrf2wtTAC組小鼠，二者之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明，Nrf2過(guò)表達(dá)能夠降低病理性壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌氧化應(yīng)激損傷。
　　 9.Nrf2轉(zhuǎn)基因小鼠Nrf2下游基因的表達(dá)
　　 在Nrf2轉(zhuǎn)基因小鼠中，假手術(shù)組的Nrf2wt和Nrf2tg小鼠的Nrf2下游基因表達(dá)水平無(wú)差異;TA

26、C術(shù)后，與Nrf2wtTAC組小鼠相比，Nrf2tgTAC組小鼠的Nrf2下游抗氧化應(yīng)激基因HO-1，NQO-1，Txn-1和Txnrd-1的mRNA表達(dá)均進(jìn)一步提高，表明Nrf2過(guò)表達(dá)可促進(jìn)其下游基因的表達(dá)增高，從而抑制壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌氧化應(yīng)激損傷。
　　 結(jié)論
　　 轉(zhuǎn)錄因子Nrf2可抑制壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大、凋亡和纖維化，促進(jìn)其下游抗氧化應(yīng)激因子HO-1，NQO-1，Txn-1和Txnrd-1的mRNA表達(dá)