抑制BMSC衰老的小分子化合物的篩選及Apocynin抗衰老作用機(jī)制的研究.pdf

1、我國(guó)是世界上老年人口最多的國(guó)家,在所有的人群中約有9000萬(wàn)人患有不同程度的骨質(zhì)疏松,因而骨質(zhì)疏松的治療和預(yù)防是極為重要的醫(yī)學(xué)課題。在骨衰老的進(jìn)程中,破骨細(xì)胞對(duì)骨的吸收速率超過(guò)了成骨細(xì)胞的骨形成的速率,成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞之間的骨代謝平衡被打破是骨量下降,骨密度降低的重要因素。而骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為成骨細(xì)胞的前體細(xì)胞,隨著衰老進(jìn)程的加劇,其增殖、分化等能力的出現(xiàn)下降的趨勢(shì)。而這也直接導(dǎo)致了骨生成的減少,這是骨質(zhì)疏松發(fā)生的一個(gè)非常關(guān)鍵的因素

2、。而由于干細(xì)胞和骨質(zhì)疏松等增齡性骨疾病之間的密切聯(lián)系使得對(duì)干細(xì)胞的相關(guān)調(diào)控研究在本領(lǐng)域具有廣闊的前景。
　　小分子化合物作為近些年的研究熱點(diǎn),被廣泛地應(yīng)用于對(duì)細(xì)胞的調(diào)控與干預(yù)的研究中。本課題的研究以新發(fā)現(xiàn)的小分子化合物庫(kù)為基礎(chǔ),從中篩選出了對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞命運(yùn)調(diào)控具有明顯影響的小分子化合物,并對(duì)其影響的機(jī)制進(jìn)行了進(jìn)一步深入的探索,同時(shí)在動(dòng)物模型上對(duì)其應(yīng)用效果進(jìn)行驗(yàn)證,篩選出了具有明顯抑制BMSCs衰老進(jìn)程的相關(guān)小分子化合物。

3、r>　　1.研究思路
　　在實(shí)驗(yàn)研究開(kāi)始階段,我們通過(guò)對(duì)國(guó)家小分子化合物資源中心所提供的24個(gè)化合物庫(kù)中的約14000種小分子化合物進(jìn)行初步的篩選。首先根據(jù)國(guó)家小分子化合物資源中心提供的對(duì)相關(guān)小分子化合物的作用方向的初步描述縮小了篩選范圍,通過(guò)對(duì)相關(guān)化合物研究進(jìn)展的查閱以及其相關(guān)作用靶點(diǎn)的分析,最終選定了目前在干細(xì)胞治療領(lǐng)域尚未進(jìn)行過(guò)相關(guān)研究,同時(shí)具有潛在的干細(xì)胞干預(yù)能力的小分子化合物共計(jì)27種,并應(yīng)用于接下來(lái)的化合物篩選的實(shí)驗(yàn)研

4、究當(dāng)中。
　　在第一部分實(shí)驗(yàn)中,首先對(duì)SD大鼠的BMSCs進(jìn)行取材,以獲得用于化合物干預(yù)實(shí)驗(yàn)的衰老的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(aging-BMSCs),隨后使用選定的27種小分子化合物以梯度濃度(1000μM、100μM、10μM、1μM)分別對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)。隨后通過(guò)使用實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)的方法對(duì)選定的27種小分子化合物作用于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行了mRNA水平的檢測(cè)。此處選用了與干細(xì)胞衰老進(jìn)程密切相關(guān)的靶點(diǎn)β–gal

5、、p53、p21、p16、Nanog、Oct-4、TERT作為篩選靶點(diǎn)進(jìn)行定量的檢測(cè)。在這一步中,我們通過(guò)對(duì)相關(guān)基因表達(dá)的定量分析初步獲得了11種對(duì)篩選靶點(diǎn)作用效果明顯的小分子化合物及其最佳作用的濃度。隨后我們通過(guò)對(duì)這11種選出的小分子化合物在同一批樣本中進(jìn)行了橫向的對(duì)比,對(duì)其作用的效果進(jìn)行了排序,并最終選定了5種小分子化合物用于進(jìn)一步的研究中(apocynin、baxchannelblocker、iso-Olomoucine、(±)b

6、ayk8644、H-9)。
　　在第二部分實(shí)驗(yàn)中,我們對(duì)選定的5種小分子化合物以最佳作用濃度對(duì)aging-BMSCs進(jìn)行干預(yù),并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了與衰老相關(guān)的多靶點(diǎn)的檢測(cè)。通過(guò)MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn),我們對(duì)細(xì)胞的增殖能力進(jìn)行了檢測(cè);通過(guò)細(xì)胞SA-β–gal活性染色實(shí)驗(yàn)。對(duì)細(xì)胞β–半乳糖苷酶活性及衰老狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè);通過(guò)RT-PCR實(shí)驗(yàn)以及WesternBlot實(shí)驗(yàn)在mRNA水平和蛋白水平分別檢測(cè)細(xì)胞衰老和分化方面的改變;通過(guò)ALP染色、茜素紅

7、(AlizarinRed)染色、ALP活性定量檢測(cè)來(lái)觀(guān)察在對(duì)細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo)后,細(xì)胞在分化水平的改變;通過(guò)流式技術(shù)(FlowCytomery)檢測(cè)來(lái)對(duì)細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡進(jìn)行相關(guān)的檢測(cè)。在本部分的實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)選定的5種小分子化合物均具有明顯逆轉(zhuǎn)或延緩衰老骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞衰老進(jìn)程的作用。
　　在第三部分實(shí)驗(yàn)中,我們對(duì)小分子化合物Apocynin抗衰老的作用進(jìn)行了更加細(xì)致的研究。首先我們?cè)隗w外實(shí)驗(yàn)中對(duì)apocynin作用于aging

8、-BMSCs的分子機(jī)制進(jìn)行了探索。通過(guò)對(duì)NADPHOxidase活性的定量檢測(cè)、細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平定量檢測(cè)及定性檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)了apocynin在衰老骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中改變衰老進(jìn)程的相關(guān)分子信號(hào)通路及其作用的方式。同時(shí),我們通過(guò)使用SAMP6早衰小鼠模型對(duì)apocynin的作用進(jìn)行了進(jìn)一步的體內(nèi)檢測(cè)。我們發(fā)現(xiàn)apocynin的作用明顯改善了p6小鼠的骨質(zhì)疏松及骨衰老的進(jìn)程。通過(guò)Micro-CT檢測(cè)apocynin干預(yù)下其骨密

9、度、骨量的改變;通過(guò)TRAP-ALP組織切片染色來(lái)檢測(cè)apocynin對(duì)骨組織中成骨-破骨細(xì)胞平衡的改變情況。同時(shí)對(duì)SAMP6小鼠的BMSCs進(jìn)行取材,通過(guò)相關(guān)體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其在衰老與分化方面的改變情況。
　　2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　第一部分小分子化合物的篩選
　　1)通過(guò)對(duì)國(guó)家小分子化合物資源中心提供的化合物庫(kù)進(jìn)行初步的梳理分析,我們從中心提供的24個(gè)化合物庫(kù)中選定了8個(gè)列出小分子化合物初步作用靶點(diǎn)或方向的化合物庫(kù)進(jìn)行篩選,

10、從這8個(gè)庫(kù)中對(duì)其列出的每個(gè)小分子化合物采用一定的篩選標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選。
　　2)根據(jù)所列出的小分子化合物的初步作用靶點(diǎn),我們選出了與干細(xì)胞治療或調(diào)節(jié)干細(xì)胞命運(yùn)密切相關(guān)的小分子化合物共計(jì)27種并訂購(gòu),開(kāi)展下一部分的研究。
　　3)通過(guò)對(duì)雄性22月大的SD大鼠進(jìn)行BMSCs的取材,并對(duì)所獲得的細(xì)胞進(jìn)行衰老鑒定,確認(rèn)了用于篩選的細(xì)胞模型符合預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)。
　　4)將27種小分子化合物稀釋成不同的濃度梯度(1000μM、100μM、1

11、0μM、1μM)分別對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù),并對(duì)干預(yù)后的細(xì)胞進(jìn)行總mRNA的收集用于RT-PCR的檢測(cè)。通過(guò)對(duì)靶點(diǎn)β–gal、p53、p21、p16、Nanog、Oct-4、TERT的檢測(cè)來(lái)判斷其對(duì)細(xì)胞衰老進(jìn)程的影響程度。據(jù)此我們選出了11中具有明顯作用的小分子化合物及其作用于細(xì)胞的最佳濃度。
　　5)接下來(lái)在同一批細(xì)胞樣本中對(duì)選定的11種小分子化合物進(jìn)行了橫向的比對(duì),使用RT-PCR檢測(cè)其作用效果,并對(duì)其影響結(jié)果進(jìn)行了定量的排序。從中選

12、出了作用效果最好的5種小分子化合物(apocynin、baxchannelblocker、iso-Olomoucine、(±)bayk8644、H-9)進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。
　　第二部分小分子化合物對(duì)Aging-BMSCs的細(xì)胞行為學(xué)的影響
　　1)在對(duì)細(xì)胞衰老進(jìn)程相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)中,我們發(fā)現(xiàn)apocynin、baxchannelblocker、iso-Olomoucine、(±)bayk8644、H-9均在不同程度上對(duì)細(xì)胞的

13、衰老進(jìn)程產(chǎn)生了影響。
　　2)我們對(duì)衰老的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行了成骨分化誘導(dǎo),并使用選定小分子化合物干預(yù)其分化的過(guò)程。在對(duì)細(xì)胞分化相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)中,我們發(fā)現(xiàn)apocynin、baxchannelblocker、iso-Olomoucine、(±)bayk8644在分化的不同階段中,均促進(jìn)了aging-BMSCs的骨向分化能力。
　　第三部分Apocynin的作用分子機(jī)制及其體內(nèi)應(yīng)用效果的研究
　　1)本部分我們對(duì)apo

14、cynin在aging-BMSCs中的分子機(jī)制及作用通路進(jìn)行了探索研究。在NADPH氧化酶的定量檢測(cè)中,我們發(fā)現(xiàn)apocynin能夠明顯抑制NOX的活性;在細(xì)胞內(nèi)活性氧的檢測(cè)中,我們發(fā)現(xiàn)apocynin的干預(yù)降低了細(xì)胞內(nèi)ROS的水平,同時(shí)我們還對(duì)p53隨細(xì)胞內(nèi)ROS的水平變化的表達(dá)在mRNA水平和蛋白水平進(jìn)行了檢測(cè),發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)ROS水平的改變與p53的表達(dá)成正相關(guān)。
　　2)接下來(lái)我們選用了SAMP6小鼠模型使用apocynin進(jìn)

15、行了體內(nèi)的干預(yù)。小鼠自3個(gè)月大時(shí)開(kāi)始接受小分子化合物的腹腔注射,在注射3個(gè)月后進(jìn)行取材分析。Micro-CT結(jié)果顯示apocynin明顯改善了骨密度及骨小梁含量;Trap-Alp組織切片染色顯示apocynin干預(yù)后,成骨細(xì)胞明顯增多,而破骨細(xì)胞水平?jīng)]有影響。
　　3)對(duì)SAMP6小鼠的BMSCs取材進(jìn)行分析,SA-β–gal染色顯示隨著細(xì)胞傳代數(shù)的增加,apocynin干預(yù)組的細(xì)胞衰老速度要低于DMSO對(duì)照組;RT-PCR結(jié)果顯

16、示,與DMSO組相比,apocynin組的p53表達(dá)減少,Oct-4表達(dá)增加;細(xì)胞增殖能力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果同時(shí)表明,apocynin干預(yù)組的細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖能力;進(jìn)行分化誘導(dǎo)后的ALP活性定量檢測(cè)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組具有更高的ALP活性。
　　3.結(jié)論
　　1)Apocynin、baxchannelblocker、iso-Olomoucine、(±)bayk8644四種小分子化合物對(duì)骨衰老過(guò)程中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的衰老進(jìn)程有著明顯的延緩

17、或逆轉(zhuǎn)作用。四種小分子化合物均能夠在細(xì)胞水平改善衰老相關(guān)基因的表達(dá),細(xì)胞的增殖、骨向分化等方面均產(chǎn)生了相關(guān)的改善現(xiàn)象。對(duì)這四種小分子化合物的進(jìn)一步探索對(duì)研究干細(xì)胞治療骨質(zhì)疏松等骨衰老疾病具有重要的意義與廣泛的研究前景。
　　2)Apocynin能夠通過(guò)下調(diào)NOX的表達(dá)來(lái)改變細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平,從而直接影響到p53的表達(dá),從而激活p53下游的一系列分子應(yīng)答機(jī)制,改善細(xì)胞的衰老狀態(tài),增加了細(xì)胞的增殖能力和分化潛能。使用apocynin