褪黑素對(duì)大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后繼發(fā)性腦損傷及認(rèn)知功能影響機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本研究分為二部分：
　　第一部分：
　　目的:研究褪黑素(Melatonin,MT)對(duì)大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)后繼發(fā)性腦損傷及認(rèn)知功能障礙的影響。
　　方法:任選80只成年雄性SD大鼠,隨機(jī)分為以下四個(gè)實(shí)驗(yàn)組:正常組、SAH組、安慰劑治療組和褪黑素治療組,將SD大鼠股動(dòng)脈非肝素化動(dòng)脈血通過1.0ml注射器注入大鼠視交叉前池,從而建立實(shí)驗(yàn)性蛛網(wǎng)膜下腔出血?jiǎng)游锬Ｐ汀Ｔ谕屎?/p>

2、素治療組,模型建立后的第2小時(shí)、24小時(shí)及36小時(shí),腹腔注射褪黑素溶液(150mg/kg)。在安慰劑治療組,模型建立后的第2小時(shí)、24小時(shí)及36小時(shí),腹腔注射生理鹽水。觀察SD大鼠SAH后神經(jīng)行為功能的變化,同時(shí)進(jìn)行神經(jīng)行為功能評(píng)分。SAH動(dòng)物模型建立完畢第48小時(shí)處死部分大鼠,取出大鼠額顳底皮層腦組織做標(biāo)本,采用TUNEL熒光染色與FLUORO-JADE B熒光染色檢測(cè)大鼠額顳底皮層腦組織神經(jīng)元細(xì)胞凋亡及壞死比率,剩余未處死SD大鼠在

3、SAH動(dòng)物模型建立完畢第48小時(shí)開始進(jìn)行Morris水迷宮試驗(yàn),檢測(cè)SD大鼠的認(rèn)知功能障礙。
　　結(jié)果:1.與正常組相比,SAH組SD大鼠的神經(jīng)認(rèn)知功能水平降低,活動(dòng)能力及飲食能力降低(P<0.05);褪黑素組SD大鼠與安慰劑組SD大鼠相比,神經(jīng)認(rèn)知功能明顯改善,食欲及活動(dòng)能力明顯好轉(zhuǎn)(P<0.01);SAH組SD大鼠和安慰劑組SD大鼠之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。2. TUNEL染色結(jié)果顯示:與正常正常組比較,SAH組SD大

4、鼠神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡百分顯著增高(P<0.01),褪黑素治療組SD大鼠神經(jīng)元細(xì)胞凋亡百分比明顯低于安慰劑治療組SD大鼠(P<0.01),而安慰劑治療組與SAH組 SD大鼠神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡百分比比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。3. Fluoro-Jade B熒光染色檢測(cè)各組大鼠神經(jīng)元細(xì)胞的壞死情況,結(jié)果顯示:與正常組相比,SAH組SD大鼠神經(jīng)元細(xì)胞壞死的百分比顯著增高(P<0.01),褪黑素治療組SD大鼠神經(jīng)元細(xì)胞壞死的百分比顯著低于安慰

5、劑治療組SD大鼠(P<0.05),而安慰劑治療組SD大鼠與SAH組SD大鼠神經(jīng)元細(xì)胞壞死的百分比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。5.在Morris水迷宮試驗(yàn)測(cè)試中,與正常組相比,SAH組SD大鼠及安慰劑組SD大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶功能明顯下降(P<0.01),且SAH組SD大鼠及安慰劑組SD大鼠之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。褪黑素組SD大鼠與安慰劑組SD大鼠相比,SD大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力有顯著提高(P<0.01)。
　　結(jié)論:褪黑

6、素(Melatonin,MT)能夠降低SD大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后繼發(fā)性神經(jīng)元細(xì)胞凋亡及壞死水平,同時(shí)明顯改善SD大鼠SAH后的空間學(xué)習(xí)等認(rèn)知功能障礙。
　　第二部分：
　　目的:建立大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH,subarachnoid hemorrhage)模型,觀察褪黑素治療后,TLR4介導(dǎo)的炎性信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的變化,如高遷移率族蛋白B1(HMGB1),Toll樣受體4(TLR4),核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB),髓樣分化因

7、子88(MyD88),白介素-1β(IL-1β),腫瘤壞死因子α(TNF-α),白介素-6(IL-6),和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶等。
　　方法:任選80只成年雄性SD大鼠,隨機(jī)分為以下四個(gè)實(shí)驗(yàn)組:正常組、SAH組、安慰劑治療組和褪黑素治療組,將SD大鼠股動(dòng)脈非肝素化動(dòng)脈血通過1.0ml注射器注入大鼠視交叉前池,從而建立實(shí)驗(yàn)性蛛網(wǎng)膜下腔出血?jiǎng)游锬Ｐ汀Ｔ谕屎谒刂委熃M,模型建立后的第2小時(shí)、24小時(shí)及36小時(shí),腹腔注射褪黑素溶液(150mg

8、/kg)。在安慰劑治療組,模型建立后的第2小時(shí)、24小時(shí)及36小時(shí),腹腔注射生理鹽水。觀察SD大鼠SAH后神經(jīng)行為功能的變化,同時(shí)進(jìn)行神經(jīng)行為功能評(píng)分。SAH動(dòng)物模型建立完畢第48小時(shí)處死各組大鼠,取出大鼠額顳底皮層腦組織做標(biāo)本,用Western blot、EMSA、PCR、ELISA及免疫組化等方法,分析測(cè)定TLR4介導(dǎo)的炎性信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的變化。
　　結(jié)果:Western blot結(jié)果顯示:高遷移率族蛋白 B1(HMGB

9、1),Toll樣受體4蛋白(TLR4),核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB P65,NF-κB P50),髓樣分化因子88(MyD88),誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)在正常組樣本中呈低水平表達(dá)。與正常組相比,SAH組樣本上述蛋白的表達(dá)水平明顯增加(P<0.01),但是在單純SAH組的表達(dá)水平與安慰劑治療組并無明顯差別(P>0.05)。在褪黑素治療組,上述蛋白的表達(dá)水平明顯低于安慰劑治療組(P<0.05)。EMSA結(jié)果顯示:通過凝膠射線顯跡顯示,正

10、常組NF-κB結(jié)合活性水平較低,而SAH組及安慰劑治療組NF-κB結(jié)合活性水平較正常組明顯上升(P<0.01)。同時(shí)在褪黑素治療組,NF-κB結(jié)合活性水平較安慰劑治療組明顯下調(diào)(P<0.05)。免疫組化結(jié)果:正常組中表達(dá)TLR4、NF-κB和iNOS的陽性細(xì)胞比率很低。SAH組及安慰劑治療組中表達(dá)TLR4、NF-κB和iNOS的陽性細(xì)胞比率明顯上升(P<0.01)。褪黑素治療組TLR4、NF-κB和iNOS的陽性細(xì)胞比率較安慰劑治療組明

11、顯下降(P<0.05)。實(shí)時(shí)定量 PCR結(jié)果:正常組 TNF-α,IL-1β,IL-6的mRMA表達(dá)水平較低,而SAH組及安慰劑治療組上述蛋白mRNA表達(dá)水平明顯增高(P<0.01),且 SAH組與安慰劑治療組上述蛋白 mRNA表達(dá)水平無明顯差異(P>0.05)。同時(shí)褪黑素治療組上述蛋白mRNA表達(dá)水平較安慰劑治療組有明顯下降(P<0.01)。ELISA結(jié)果顯示:正常組IL-1β,TNF-α和IL-6濃度較低,SAH組及安慰劑治療組IL