堿性成纖維細(xì)胞生長因子促進(jìn)人肝癌Bel-7402細(xì)胞增殖的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制.pdf

1、目的： 堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)屬于有絲分裂原，通過與成纖維細(xì)胞生長因子受體(fibroblast growth factor receptor，F(xiàn)GFR)結(jié)合，激活磷脂酰肌醇—3—激酶(Phosphoinositide3—kinase，PI3K)/蛋白激酶B(Protein kinase B，PKB)等信號通路，在影響細(xì)胞增殖、分化及生存方面起關(guān)鍵作用。腫

2、瘤是細(xì)胞增殖、分化和凋亡異常引起的以細(xì)胞失控性生長和增殖為主要特征的疾病，對細(xì)胞增殖和分裂至關(guān)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制是腫瘤研究的焦點(diǎn)。 細(xì)胞周期調(diào)控異常是腫瘤發(fā)病的主要機(jī)制，腫瘤轉(zhuǎn)化大部分是G1、G2期機(jī)制失調(diào)的結(jié)果。P13K/PKB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在癌細(xì)胞中上調(diào)，經(jīng)常通過促進(jìn)G1—S期細(xì)胞周期進(jìn)程，刺激腫瘤細(xì)胞增殖。研究表明，肝癌過度表達(dá)bFGF和FGFR1，可能通過自分泌或旁分泌等方式發(fā)揮作用，由bFGF激活的P1

3、3K/PKB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。FOXO1轉(zhuǎn)錄因子是PI3K/PKB直接的下游信號分子，通過調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)在控制細(xì)胞周期進(jìn)程、DNA修復(fù)、抵御氧化損傷和凋亡中起重要作用，F(xiàn)OXO活性降低或功能缺失可能導(dǎo)致細(xì)胞的無限增殖和瘤的轉(zhuǎn)化，被看作是腫瘤抑制因子。 p27是細(xì)胞周期素依賴激酶(cyclin dependent kinase，CDK)的抑制蛋白，主要通過抑制CDK或Cyclin/CDK復(fù)合物活性，阻斷G

4、1—S轉(zhuǎn)換，對細(xì)胞周期進(jìn)行負(fù)調(diào)控，是關(guān)鍵的閘門抑制因子，其表達(dá)及代謝發(fā)生異?？蓪?dǎo)致細(xì)胞周期失控并促進(jìn)細(xì)胞異常增殖。在腫瘤中p27的調(diào)節(jié)主要發(fā)生在翻譯后水平，最主要的是通過泛素一蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-Proteasome system，UPS)降解。在泛素化過程中，S期激酶相關(guān)蛋白2(S-Phase kinase—associated protein2，Skp2)能特異性識別磷酸化的底物，是介導(dǎo)p27泛素化和降解的重要蛋白。S

5、kp2是一種癌蛋白，在人類很多惡性腫瘤中，Skp2的蛋白表達(dá)通常很高，與p27的蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，而且，Skp2表達(dá)水平越高，腫瘤的惡性程度越高，侵襲性越強(qiáng)，表明Skp2依賴的p27蛋白質(zhì)降解在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有重要作用。 目前關(guān)于bFGF調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖的P13K/PKB通路與FOXO1、p27以及Skp2之間的關(guān)系尚不十分清楚。本研究利用無血清培養(yǎng)使人肝癌Bel—7402細(xì)胞同步化，觀察外源性bFGF對細(xì)胞增殖、PKB、FO

6、XO1活性以及p27、Skp2表達(dá)的影響，以探討bFGF對人肝癌Bel—7402細(xì)胞增殖的調(diào)控作用及可能的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。 方法： 1、肝癌Bel—7402細(xì)胞同步化后無血清饑餓培養(yǎng)，分別加入bFGF、Wortmannin(PKB上游激酶P13K的特異性抑制劑)，繼續(xù)饑餓培養(yǎng)至不同時間。 2、MTT、流式細(xì)胞術(shù)等觀察bFGF、Wortmannin對饑餓培養(yǎng)誘導(dǎo)的Bel—7402細(xì)胞增殖的影響。 3、West

7、ern blot法檢測bFGF、Wortmannin對饑餓培養(yǎng)的Bel—7402細(xì)胞蛋白激酶PKB、FOXO1的激活作用，對p27、Skp2表達(dá)的影響及其可能的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。免疫熒光檢測bFGF、Wortmannin對饑餓培養(yǎng)的Bel—7402細(xì)胞p—FOXO1分布的影響。 4、RT-PCR法檢測bFGF、Wortmannin對饑餓培養(yǎng)的Bel—7402細(xì)胞Skp2、p27 mRNA表達(dá)的影響及其可能的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。 結(jié)

8、果： 1、外源性bFGF呈劑量、時間依賴性迅速激活肝癌Bel—7402細(xì)胞PKB活性，PKB蛋白總量表達(dá)無改變。Wortmannin(PKB上游激酶PI3K抑制劑)可部分抑制bFGF的上述作用。與bFGF組相比，Wortmannin組PKB活性約下降36.80％(P<0.01)。bFGF呈時間依賴性磷酸化FOXO1，免疫熒光顯示bFGF可誘導(dǎo)磷酸化FOXO1出胞核進(jìn)入胞漿，Wortmannin可部分阻斷FOXO1的磷酸化。

9、 2、MTT結(jié)果顯示：Bel—7402細(xì)胞經(jīng)bFGF處理細(xì)胞增殖比明顯增加，且與bFGF水平成劑量依賴關(guān)系，bFGF濃度為25 ng/ml時細(xì)胞增殖比最高為145％，各bFGF處理組與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，經(jīng)Wortmannin預(yù)處理后可抑制細(xì)胞增殖(P<0.01)。 3、流式細(xì)胞術(shù)分析顯示：Bel—7402細(xì)胞經(jīng)25 ng/ml bFGF孵育16 h后，與對照組相比G1期細(xì)胞減少(75.56±4.12)％→

10、(57.50±3.75)％，S期細(xì)胞增多(16.53±1.95)％→(30.13±4.03)％，bFGF促進(jìn)細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期(P<0.01)。Wortmannin使bFGF促進(jìn)細(xì)胞周期的作用受到抑制[G1期：(67.53±2.30)％，S期：(22.63±2.54)％，P<0.05]。 4、bFGF呈時間依賴性誘導(dǎo)饑餓培養(yǎng)的Bel—7402細(xì)胞Skp2的mRNA及蛋白表達(dá)增加。bFGF處理6h時Skp2 mRNA達(dá)峰值，8h

11、時Skp2蛋白表達(dá)最高，Wortmannin可抑制bFGF對Skp2的誘導(dǎo)作用(P<0.01)。 5、bFGF對饑餓培養(yǎng)的Bel—7402細(xì)胞p27 mRNA的表達(dá)無影響，但可抑制p27蛋白表達(dá)。bFGF處理10 h時p27蛋白表達(dá)最低，Wortmannin和蛋白酶體抑制劑MG—132可抑制此誘導(dǎo)作用(P<0.05)。 結(jié)論： 1、bFGF經(jīng)PI3K途徑迅速激活Bel—7402細(xì)胞PKB、磷酸化FOXO1。