Fas-AD誘導(dǎo)Bel-7402細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制.pdf

1、目的： Fas也稱Apo-1或CD95，是腫瘤壞死因子(TNFR)/神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體(NGFR)家族的一個(gè)代表，在生理和病理的凋亡過(guò)程中廣泛涉及，如腫瘤監(jiān)視、免疫功能、爆發(fā)性肝炎和神經(jīng)再生等。Fas曾經(jīng)在抗癌治療中被使用，然而在治療應(yīng)用上Fas受到很大限制，這是由于它的毒性和激活NF-kB家族轉(zhuǎn)錄因子，NF-kB易引起炎癥和抗凋亡的作用。在體外，為了克服這些問(wèn)題，特殊的NF-kB抑制劑、轉(zhuǎn)錄和蛋白合成抑制劑放線菌素D被應(yīng)用，通過(guò)

2、放線菌素D(actinomycin D，AD)處理細(xì)胞，使對(duì)Fas抗體介導(dǎo)的凋亡不敏感的細(xì)胞株變得敏感，這是由于放線菌素D能激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)，在誘導(dǎo)凋亡過(guò)程中提供了與Fas協(xié)同的共刺激信號(hào)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。 凋亡或程序性死亡在胚胎形成和發(fā)展中是重要的現(xiàn)象，它維持著機(jī)體的自我平衡。對(duì)于敏感細(xì)胞，當(dāng)Fas受體與Fas配體或可溶性Fas抗體相結(jié)合時(shí)，F(xiàn)as受體三聚化作用導(dǎo)致細(xì)胞凋亡．對(duì)于Fas抗體誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制已經(jīng)進(jìn)行了初步的

3、研究，在Fas-AD誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程中可以激發(fā)多個(gè)信號(hào)途徑，其中以caspase蛋白激酶執(zhí)行細(xì)胞有秩序的死亡而聞名。 在哺乳動(dòng)物細(xì)胞，凋亡是以依賴線粒體途徑和非依賴線粒體途徑兩條途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Bcl-2家族蛋白在調(diào)節(jié)線粒體凋亡途徑中起到一個(gè)中心作用。Bcl-2家族蛋白的作用位點(diǎn)主要在線粒體膜上，能刺激線粒體細(xì)胞色素C的釋放，細(xì)胞色素C與Apaf-1一起激活caspase-9，easpase-9激活easpase-3隨之導(dǎo)致

4、凋亡。對(duì)于非依賴線粒體途徑：主要通過(guò)死亡受體(FaLs associated death domain，F(xiàn)ADD)作用激活easpase-8，進(jìn)而激活下游的easpase-3，從而引起細(xì)胞凋亡。Caspase-8除了直接激活caspase-3外，還可以通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路間接激活caspase-3。 在兩個(gè)途徑中，最后步驟涉及到依靠大量的多蛋白復(fù)合體caspase從鈍化的形式變?yōu)榧せ钚问剑坏┘せ?，caspase斷裂各種底物導(dǎo)致細(xì)胞死

5、亡，在此過(guò)程中caspase-8是頂端的caspase，對(duì)于啟動(dòng)Fas誘導(dǎo)的凋亡是非常重要的。在caspase亞家族中，對(duì)于理解凋亡，caspase-3由于其易變底物的特殊性而尤其重要。 RB腫瘤抑制蛋白在通過(guò)G1/S調(diào)控點(diǎn)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期中起主導(dǎo)作用，參與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)。通常認(rèn)為失活的RB在G1/S臨界點(diǎn)通過(guò)磷酸化釋放E2F轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)細(xì)胞周期基因表達(dá)，加速S期進(jìn)入引起細(xì)胞增殖。RB還有很多其他的細(xì)胞功能，包括介導(dǎo)分化的信號(hào)，在有

6、絲分裂過(guò)程中調(diào)節(jié)染色體分離，維持基因的完整性。擾亂這些RB功能的途徑能潛在的引起增殖的增高或基因的不穩(wěn)定導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。 有絲分裂原蛋白激酶已經(jīng)被暗示是凋亡的上游信號(hào)，包括ERK1/2、JNK、p38和ERK5亞家族。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞，它們是由不同的外界刺激物(如紫外線和滲透性刺激等)調(diào)節(jié)的獨(dú)立模型，通過(guò)傳導(dǎo)不同信號(hào)導(dǎo)致細(xì)胞的增殖、分化和凋亡。在死亡受體誘導(dǎo)凋亡的過(guò)程中，這個(gè)途徑的作用還不太清楚，可能依靠特殊的死亡受體和細(xì)胞類型。

7、 目前，關(guān)于Fas-AD誘導(dǎo)Bel-7402腫瘤細(xì)胞凋亡的過(guò)程中，P38MAPK與caspase-8是否一起參與，P38MAPK與caspase家族之間的關(guān)系，以及P38MAPK、caspase與Bcl-2、Rb的關(guān)系還不清楚，本研究利用Fas-AD誘導(dǎo)Bel-7402細(xì)胞凋亡，通過(guò)P38MAPK抑制劑SB203580及caspase-8抑制劑Ac-IEFD-cho的作用，來(lái)確定P38MAPK、caspase-8、caspase

8、-3及Bcl-2、RB的關(guān)系，進(jìn)一步揭示Fas-AD誘導(dǎo)Bel-7402細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。 方法： 1、通過(guò)MTT法檢測(cè)Fas-AD作用后的Bel-7402細(xì)胞活力，濃度下的不同作用時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)。 2、通過(guò)倒置顯微鏡、電子顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測(cè)在Fas抗體不同F(xiàn)as、Fas-AD、SB203580(P38MAPK 特異性抑制劑)及Ac-IEFD-cho(caspase-8特異性抑制劑)對(duì)Bel-7402細(xì)胞凋

9、亡的影響。 3、通過(guò)Western-blot法、RT-PCR法檢測(cè)Fas-AD、SB203580及Ac-IEFD-cho對(duì)培養(yǎng)的Bel-7402細(xì)胞的P38MAPK、caspase-8、caspase-3的激活作用，對(duì)FasR、Bcl-2、RB表達(dá)的影響及其可能的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。 4、利用激光共聚焦顯微鏡通過(guò)免役熒光法檢測(cè)Fas-AD、SB203580及Ac-IEFD-cho作用后P38MAPK與caspase-3的細(xì)胞內(nèi)定位。

10、 5、通過(guò)免疫沉淀法確定P38MAPK與caspase-3的作用關(guān)系，caspase-3與RB的作用關(guān)系及其可能的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。 結(jié)果： 1、Fas-AD能明顯抑制Bel-7402細(xì)胞增殖，且隨Fas抗體濃度及其作用時(shí)間呈依賴關(guān)系。 2、Fas-AD能明顯誘導(dǎo)Bel-7402細(xì)胞凋亡，SB203580和Ac-IEFD-cho能明顯抑制Fas-AD誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。 倒置顯微鏡下觀察顯示，F(xiàn)as-AD作

11、用24 h后能明顯地誘導(dǎo)Bel-7402細(xì)胞凋亡，細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)大量空泡，核仁的數(shù)量減少，死亡細(xì)胞較多。SB203580和Ac-IEFD-cho分別單獨(dú)作用時(shí)能改善這種現(xiàn)象，死亡細(xì)胞相對(duì)較少；當(dāng)兩個(gè)抑制劑共同作用時(shí)能明顯改善這種現(xiàn)象，細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)微量小泡，核仁較多。 電子顯微鏡下觀察顯示，F(xiàn)as-AD作用24 h后，Bel-7402細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡特征，細(xì)胞體積變小，胞質(zhì)濃縮，胞漿內(nèi)空泡增多，染色質(zhì)固縮、邊集或碎裂成不規(guī)則塊狀，出現(xiàn)

12、凋亡小體。SB203580組和Ac-IEFD-cho組可見(jiàn)細(xì)胞膜相結(jié)構(gòu)完整，胞漿內(nèi)空泡相對(duì)減少，染色質(zhì)邊緣聚集，線粒體腫脹。SB203580和Ac-IEFD-cho共同作用組，未出現(xiàn)明顯的凋亡特征，胞漿可見(jiàn)少量小泡。 Annexin-V FITC/PI雙標(biāo)流式細(xì)胞術(shù)分析顯示：Fas-AD作用24 h后，與對(duì)照組比較Fas-AD組能明顯誘導(dǎo)Bel-7402細(xì)胞凋亡，凋亡率為50.55±3.25％，SB203580和Ac-IEFD-

13、cho單獨(dú)或共同作用都能明顯的抑制Fas-AD誘導(dǎo)的凋亡。 3、Fas-AD能明顯誘導(dǎo)Bel-7402細(xì)胞FasR表達(dá)。 Westem-bolt結(jié)果顯示，F(xiàn)as-AD誘導(dǎo)培養(yǎng)的Bel-7402細(xì)胞的FasR表達(dá)，并且FasR隨Fas抗體濃度呈劑量依賴性增加，但當(dāng)Fas抗體濃度為10 μM時(shí)，F(xiàn)asR表達(dá)增加量減緩。 4、P38MAPK與caspase-8參與Fas-AD凋亡途徑，并且相互調(diào)節(jié)。 P38MA

14、PK抑制劑SB203580和caspase-8抑制Ac-IEFD-cho阻礙FaS-AD誘導(dǎo)凋亡的作用明顯顯示，P38MAPK和caspase-8在Fas-AD誘導(dǎo)的凋亡中起重要作用。 5、在Fas-AD誘導(dǎo)Bel-7402細(xì)胞凋亡過(guò)程中，通過(guò)抑制劑SB203580和Ac-IEFD-cho的作用發(fā)現(xiàn)P38MAPK和caspase-8調(diào)節(jié)Bcl-2、Rb的表達(dá)，P38MAPK和caspase-8能明顯地降低BCl-2的表達(dá)，增加R

15、B的表達(dá)。 6、P38MAPK和caspase-8調(diào)節(jié)caspase-3的表達(dá)。 Western-blot結(jié)果顯示，F(xiàn)as-AD誘導(dǎo)caspase-3表達(dá)并發(fā)生斷裂激活，并且斷裂片段表達(dá)隨Fas抗體濃度增加呈劑量依賴性增加，而抑制劑SB203580和Ac-IEFD-cho能明顯地抑制其表達(dá)和激活。 7、當(dāng)Fas-AD作用Bel-7402細(xì)胞24 h時(shí)，在Fas-AD誘導(dǎo)Bel-7402細(xì)胞凋亡過(guò)程中P38MAPK

16、與caspase-3從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核形成P38MAPK/caspase-3復(fù)合體，而抑制劑SB203580和Ac-IEFD-cho能明顯地抑制他們的轉(zhuǎn)位。 8、當(dāng)Fas-AD作用Bel-7402細(xì)胞48 h時(shí)，caspase-3與RB相互作用并形成caspase-3/RB復(fù)合體。 結(jié)論： 1、Fas-AD抑制Bel-7402細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)Bel-7402細(xì)胞凋亡。 2、Fas-AID經(jīng)P38MAPK、

17、caspase-8信號(hào)通路誘導(dǎo)Bel-7402細(xì)胞凋亡。 3、在Fas-AID誘導(dǎo)Bel-7402細(xì)胞凋亡過(guò)程中，P38MAPK與caspase-8相互調(diào)節(jié)，不僅從蛋白總量而且還從激活(磷酸化形式或斷裂形式)的表達(dá)上相互影響，再有從mRNA水平也相互調(diào)節(jié)。 4、Fas-AD通過(guò)激活P38MAPK、caspase-8從而引起caspase-3的激活，作用下游底物Bcl-2、RB調(diào)節(jié)其表達(dá)。 5、在Fas-AD誘導(dǎo)B