中藥活性成分中空纖維細(xì)胞捕獲及漂浮有機(jī)液滴凝固液相微萃取分析.pdf

1、本文首次提出一種研究中藥中活性成分群的新方法一中空纖維細(xì)胞捕獲偶合高效液相色譜法(hollowfibercellfishingwithhighperformanceliquidchromatography，HFCF-HPLC)。HFCF-HPLC是將孔壁或內(nèi)腔充滿活細(xì)胞的中空纖維插入pH7.4的中藥提取液中，在模擬人體吸收和一定的攪拌速度下，中空纖維孔壁或內(nèi)腔的活細(xì)胞對(duì)中藥提取液中活性成分進(jìn)行篩選，篩選到的活性成分分子透過(guò)中空纖維壁孔并

2、進(jìn)入腔內(nèi)被細(xì)胞捕獲。篩選結(jié)束后，利用一定的溶劑或溶液將與細(xì)胞結(jié)合的活性成分解離或洗脫并進(jìn)行HPLC分析。本文在對(duì)空白和細(xì)胞中空纖維表面性質(zhì)表征的基礎(chǔ)上，對(duì)中空纖維活性中心與目標(biāo)物的非特異性結(jié)合和HFCF-HPLC方法的重現(xiàn)性進(jìn)行了研究；利用HFCF-HPLC分別對(duì)中藥材五味子提取液中的木脂素類成分群和蛇床子、補(bǔ)骨脂提取液中的香豆素類成分群進(jìn)行了篩選、捕獲和分析；通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品的色譜保留時(shí)間對(duì)照，對(duì)篩選出與細(xì)胞結(jié)合的部分活性成分進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒

3、別。HFCF-HPLC(1)避免了由于生物學(xué)特征受到影響而引起有效成分篩選和測(cè)定的差異；(2)不需制備生物膜固定相和裝柱，細(xì)胞用量少，成本低；(3)篩選過(guò)程與色譜過(guò)程分步進(jìn)行，可分別滿足生物體內(nèi)自然吸收條件和色譜分離的最佳條件；(4)活性篩選和樣品凈化同時(shí)完成，免去了其他中藥活性篩選法所必需的樣品前處理過(guò)程。HFCF-HPLC在對(duì)中藥五味子中木脂素類成分群和蛇床子、補(bǔ)骨脂提取液中香豆素類成分群篩選、捕獲、分析中得到成功應(yīng)用，無(wú)疑為中藥活

4、性成分的篩選和研究提供一種普適、高效、方便的新方法。
　　 本文通過(guò)分析比較漂浮有機(jī)液滴凝固液相微萃取(SFODLPME)對(duì)上述方法篩選出的木脂素活性成分群萃取前后紫外光譜的改變，提出了超分子有序聚集凝固液相微萃取(SSMOALPME)機(jī)理；建立了簡(jiǎn)單、快速、靈敏的SSMOALPME高效液相色譜法(HPLC)同時(shí)測(cè)定中藥五味子中5種低豐度木脂素類化合物含量的方法，并對(duì)不同產(chǎn)地五昧子的質(zhì)量進(jìn)行比較和評(píng)價(jià)。對(duì)漂浮有機(jī)液滴凝固液相微萃

5、取的各參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的液相微萃取條件：在10mL的供相溶液中，加入混合工作液或供試品溶液400μL，甲醇300μL，1mol/LHCl500μL,4.27mol/LNaCl2mL。取20μL正十二醇于樣品溶液表面，蓋蓋。在600rpm的轉(zhuǎn)速下萃取40min，此時(shí)供相形成白色云霧狀的微乳液。萃取結(jié)束后靜置，并將玻璃瓶放入-20℃的冰箱中冷凍，6min后取出，正十二醇在溶液表面凝固，用小勺將正十二醇固體取出放入小燒杯中，室溫融化后，用

6、50μL甲醇稀釋，取20μL溶液進(jìn)行HPLC分析。色譜分離條件：EclipseXDB-Cl8柱(5μm，150mm×4.6mmi.d.AgilentTechnologies)，檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm，柱溫35℃，進(jìn)樣量20μL，流動(dòng)相甲醇(A)-0.6％（體積）磷酸(B)，用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，梯度洗脫程序：0→4.5min,A∶B(v∶v)=70∶30,0.8mL/min;4.5→5min,A∶B(v∶v)=85∶15,1mL/m

7、in;5→13min，A∶B(v∶v)=76∶24，1mL/min。在最佳的SSMOALPME條件下，測(cè)得五味子醇甲，五味子酯甲，五味子甲素，五味子乙素，五味子丙素的線性范圍分別為2.48×10-3～6.21、2.27×10-3～28.5、2.31×10-3～28.8、2.27×10-3～5.69、1.05×10-3～5.25μg/mL；檢測(cè)限分別為：0.4、0.4、0.4、0.08、0.08ng/mL；日內(nèi)、日間精密度RSD＜9.7％