ET-1干擾后對肺癌的凋亡、侵襲、增殖的影響.pdf

1、目的:
　　肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，威脅著全世界人民生命和健康。同時，它也是世界上發(fā)病率和死亡率增長最快的疾病之一，而且大多數(shù)肺癌患者到晚期才被診斷。在現(xiàn)階段肺癌的治療中，它仍然是無法治愈的。Endothelin(ET)由內(nèi)皮細(xì)胞合成，是一種生物活性肽，是一種強(qiáng)烈的血管收縮劑，具有很強(qiáng)的收縮血管作用，隨著對內(nèi)皮素研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮素與腫瘤關(guān)系密切，對腫瘤細(xì)胞的生長、增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡及化學(xué)耐藥等方面都有影響。ET能夠產(chǎn)

2、生細(xì)胞生長因子，可以促進(jìn)腫瘤DNA合成，基因表達(dá)和腫瘤細(xì)胞增殖。ET有21種氨基酸組成。有研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮素家族有四個同分異構(gòu)體亞型包括ET-1 ET-2 ET-3和ET-4。目前的研究中，大部分的研究集中在ET-1。ET-1能夠通過直接或間接旁分泌的方式促進(jìn)腫瘤血管生成。ET-1蛋白水平在部分惡性腫瘤中是升高的，如膀胱癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、卵巢癌，包括肺癌。研究表明，ET-1在肺癌中高度表達(dá)并且參與了肺癌細(xì)胞增殖。但是，內(nèi)皮素與腫瘤的

3、生長和轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系尚未完全闡明。我們通過研究ET-1干擾對肺癌的影響來了解ET-1與肺癌的增殖、侵襲、凋亡關(guān)系，從而為ET-1作為肺癌治療靶點提供依據(jù)，并且通過目前廣泛應(yīng)用于臨床的抗腫瘤藥物恩度觀察兩者是否具有協(xié)同作用。
　　方法:
　　1.構(gòu)建含有干擾ET-1質(zhì)粒(設(shè)計3個不同的質(zhì)粒編號538、297、321)的載體，通過熒光定量PCR方法從中篩選出干擾效率最高的質(zhì)粒載體（編號321），并將干擾效率最高的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549

4、細(xì)胞株，檢測轉(zhuǎn)染效率。
　　2.ET-1干擾后細(xì)胞增殖侵襲凋亡能力的檢測:設(shè)立ET-1正常表達(dá)組，ET-1干擾組，空載組，恩度組，ET-1干擾聯(lián)合恩度組，空載+恩度組5個實驗組。利用CCK-8檢測細(xì)胞增殖變化;流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡細(xì)胞周期情況;Transwell檢測侵襲能力。
　　3.WB檢測RhoA/C，VEGF, PEDF, AKT, E-cadherin，and Cox-2相關(guān)增殖、侵襲、凋亡相關(guān)蛋白的變化。

5、>　　4.ET-1干擾后穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞組，注射裸鼠皮下。12只裸鼠隨機(jī)分為兩組，對照組和實驗組。對照組接種A549 sh-NC細(xì)胞;實驗組接種A549 sh-ET-1細(xì)胞。待成瘤后游標(biāo)卡尺測量瘤子大小;待瘤子長大后將裸鼠處死，取出瘤子進(jìn)行稱重。
　　結(jié)果:
　　1.ET-1 siRNA對A549細(xì)胞增殖的影響通過研究發(fā)現(xiàn)，ET-1 siRNA能有效抑制A549細(xì)胞增殖。此外，通過Endostar與ET-1 siRNA聯(lián)合組的影響比

6、單獨(dú)使用Endostar或ET-1 siRNA組對增殖的影響都要明顯。
　　2.ET-1 siRNA對A549細(xì)胞侵襲能力檢測通過研究發(fā)現(xiàn)，ET-1 SiRNA可以顯著降低腫瘤細(xì)胞的侵襲力。ET-1 SiRNA與Endostar聯(lián)合組抑制腫瘤侵襲力的效果與其他組相比更明顯。
　　3.ET-1 siRNA對A549細(xì)胞凋亡能力檢測通過研究發(fā)現(xiàn)，ET-1 SiRNA可以顯著增加腫瘤細(xì)胞的凋亡，ET-1 siRNA與Endosta

7、r二者對增加腫瘤細(xì)胞凋亡效應(yīng)有協(xié)同作用。
　　4.ET-1 siRNA對A549細(xì)胞周期的影響通過研究發(fā)現(xiàn)，ET-1 siRNA能有效抑制A549細(xì)胞增殖。此外，通過Endostar與ET-1 siRNA聯(lián)合組的影響比單獨(dú)使用Endostar或ET-1siRNA組對增殖的影響都要明顯。
　　5.ET-1 siRNA通過WB檢測了RhoA/C，VEGF, PEDF, AKT, E-cadherin，andCox-2等相關(guān)蛋白的

8、變化通過研究發(fā)現(xiàn)，在ET-1 SiRNA能明顯降低肺癌細(xì)胞侵襲、增殖能力，增加肺癌細(xì)胞的凋亡能力。 ET-1 siRNA與Endostar二者對抑制肺癌細(xì)胞的侵襲、增殖，增加肺癌細(xì)胞的凋亡能力有協(xié)同作用。
　　6.ET-1 SiRNA裸鼠體內(nèi)成瘤測量瘤體腫瘤體積重量我們發(fā)現(xiàn)ET-1 SiRNA在體內(nèi)能有效抑制腫瘤生長。
　　結(jié)論:
　　1.高表達(dá)的ET-1肺癌細(xì)胞株A549，通過抑制ET-1表達(dá)后我們發(fā)現(xiàn)能抑制肺癌細(xì)胞