纈沙坦對JNK通路介導(dǎo)的糖尿病鼠腎組織細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、目的:糖尿病腎病(Diabetic Kidney Disease,DKD)是糖尿病(DiabetesMellitus,DM)常見而難治的微血管并發(fā)癥,據(jù)報道,約20％～40％的糖尿病人會出現(xiàn)此并發(fā)癥,如不早期發(fā)現(xiàn)并治療,最終將導(dǎo)致終末期腎病,其中5％～8％的患者死于尿毒癥。因此,有效地防治糖尿病腎病,已成為當(dāng)前研究糖尿病和腎臟病學(xué)者們共同研究的重要課題。血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)在糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展中起重要作用。纈沙坦,為AngⅡ受體拮抗

2、劑,AngⅡ受體拮抗劑(ARB)可在受體水平上完全阻斷AngⅡ的作用而起腎保護(hù)作用。目前纈沙坦抗糖尿病鼠腎組織細(xì)胞凋亡的作用及其與c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)通路關(guān)系的研究鮮見報道。本課題應(yīng)用糖尿病大鼠模型,分別于實(shí)驗(yàn)的第4、8周末檢測血生化指標(biāo),24h尿蛋白定量,檢測糖尿病大鼠腎組織凋亡信號調(diào)節(jié)激酶(apoptosis signalingregulation kinasel,ASK1

3、)、絲裂原活化蛋白激酶(MAP Kinase Kinase7,MKK7)、JNK和磷酸化c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase phosphorylation,p-JNK)的表達(dá),并予以纈沙坦干預(yù),以探討纈沙坦對糖尿病腎病大鼠腎臟的保護(hù)作用及其機(jī)制。
　　 方法:
　　 清潔級Wistar大鼠45只,隨機(jī)選取10只設(shè)為正常對照組(N組),其余35只采用腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozo

4、tocin,STZ,溶于0.1mol/L枸櫞酸鹽緩沖液中,pH值為4.5,60mg/kg)制備糖尿病模型,N組僅注射等體積的枸櫞酸鹽緩沖液,72 h后從尾尖取血,測血糖≥16.7mmol/L者確定為糖尿病模型,隨機(jī)再分為兩組:糖尿病組(DM組)17只,纈沙坦干預(yù)組(T組)17只(實(shí)驗(yàn)期間有1只大鼠造模未成功棄去)。T組在糖尿病模型建成后即刻給予纈沙坦10mg/kg·d溶于等量蒸餾水中灌胃,N組和DM組僅給予等量蒸餾水灌胃。實(shí)驗(yàn)期間所有大

5、鼠自由飲水進(jìn)食,各組大鼠不使用胰島素及其他降糖藥物。所有大鼠每周稱一次體重,并分別于第2、4、8周測一次血糖,收集24小時尿液。大鼠于灌胃后第4和第8周時每組隨機(jī)處死半數(shù),測血糖(Glu)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(CHOL)、血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、尿酸(UA)、血白蛋白(ALB)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL);測24小時尿蛋白定量;切取腎臟做如下觀察:1.免疫組織化學(xué)法檢測各組腎組織ASK1、JNK、

6、p-JNK的表達(dá)情況;2.應(yīng)用Western blotting檢測ASK1、MKK7、JNK、p-JNK蛋白表達(dá);3.流式細(xì)胞學(xué)檢測腎組織細(xì)胞凋亡率;4.收集并整理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　 結(jié)果:
　　 1.試驗(yàn)前各組大鼠體重、血糖基礎(chǔ)值無顯著性差異(p＞0.05),條件齊同。
　　 2.僅8周時DM組、T組尿蛋白與N組比較排出量明顯增多,T組較DM組減少,有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.0

7、5)。
　　 3.體重和腎重指數(shù)變化:DM組和T組大鼠在第8周末體重明顯減輕,4周末腎重指數(shù)較N組明顯增加(P＜0.01),T組與DM組相比有所減弱;8周末DM組腎重指數(shù)與N組比較,明顯增加(P＜0.01),T組腎重指數(shù)較DM組減小,但仍高于N組(P＜0.01)。
　　 4.腎功能測定:4周與8周時BUN、Scr、UA比較:同期的DM組、T組與N組比較各指標(biāo)水平均無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 5.免疫組織

8、化學(xué)檢測結(jié)果:
　　 ASK1的表達(dá):N組在4周時ASK1表達(dá)較弱,主要以腎皮質(zhì)部分遠(yuǎn)端腎小管為主;DM組于第4周,ASK1的表達(dá)不只局限于腎小管,部分腎小球亦可見弱陽性表達(dá),較N組有統(tǒng)計學(xué)意義上的增多(P＜0.05);第8周末,DM組皮質(zhì)腎小管及腎小球ASK1表達(dá)進(jìn)行性增加,腎小管表達(dá)增加更明顯,趨向彌散性分布,與N組相比有明顯統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05);T組ASK1的表達(dá)部位及隨時間的變化趨勢與DM組大致相同,4周時其表達(dá)較

9、N組增多,較DM組減少,均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),在第8周末表達(dá)較DM組有統(tǒng)計學(xué)意義上的減弱(P＜0.05);
　　 JNK,p-JNK的表達(dá):JNK在正常腎組織(N組)幾乎無表達(dá),在DM組和T組可見其在腎小管有所表達(dá);p-JNK在正常腎組織(N組)表達(dá)量極少,在DM組和T組可見腎小管有表達(dá),隨時間推移,腎小球也可見少量表達(dá):4周時DM組較N組明顯升高(P＜0.05),T組較DM組降低但無統(tǒng)計學(xué)意義;8周時DM組較N組明顯

10、升高(P＜0.05),TN較DM組表達(dá)降低、較N組表達(dá)增高,均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 6.Westem blotting結(jié)果:
　　 ASK1的表達(dá):N組表達(dá)較弱,DM組在4、8周的表達(dá)較N組增多;T組4、8周的表達(dá)量均較同期的N組增多,與同期DM組相比均有減弱,有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);
　　 MKK7的表達(dá):4周時DM組、T組和N組,兩兩組間比較均不具有統(tǒng)計學(xué)意義;8周時DM組表達(dá)量較N組增

11、多明顯,有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05),T組也較N組增多,較DM組減少,均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05);
　　 JNK的表達(dá):4周時DM組、T組與N組相比無明顯差異;8周時DM組較N組有所增加,T組與DM組相比有所降低并有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05),與N組相比無差異(P＞0.05);
　　 P-JNK的表達(dá):在第4周三組表達(dá)無明顯差異;在第8周DM組和T組表達(dá)較N組均增高并有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05);T組較DM組有所減弱

12、,有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 7.流式細(xì)胞法測凋亡率結(jié)果:
　　 4周時DM組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡率較N組升高(P＜0.05),T組與DM組相比凋亡率降低,有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),與N組相比無明顯差異;8周時DM組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡率較N組增加更明顯(P＜0.05),T組與DM組相比凋亡率也明顯降低且有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),T組較N組凋亡率升高,有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 8.MKK

13、7、JNK、p-JNK、ASK1與凋亡率的Pearson相關(guān)性分析:MKK7、JNK、p-JNK、ASK1與凋亡率的相關(guān)系數(shù)分別為r=0.908、0.838、0.870、0.861,P＜0.05。
　　 結(jié)論:
　　 糖尿病大鼠腎臟病變發(fā)展過程中,腎組織ASK1,MKK7,JNK,p-JNK的表達(dá)均增高,提示它們可能參與糖尿病腎臟病變的發(fā)病機(jī)制,而應(yīng)用纈沙坦干預(yù)后其表達(dá)可有明顯減弱,由JNK通路引起的細(xì)胞凋亡率也降低,提