纈沙坦防治糖尿病腎病腎間質(zhì)纖維化作用機(jī)制的研究.pdf

1、背景與目的：
　　 糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病常見的微血管并發(fā)癥,也是導(dǎo)致終末期腎臟病(end-stage renal disease,ESRD)的主要病因之一,腎間質(zhì)纖維化是ESRD的共同的病理學(xué)特點(diǎn),因而盡早的延緩甚至逆轉(zhuǎn)腎間質(zhì)纖維化對(duì)防治DN進(jìn)展有重要意義。纈沙坦作為一種血管緊張素受體拮抗劑,具有腎臟保護(hù)作用,其治療糖尿病腎病防治間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制尚未完全明了。本研究以大鼠糖尿病

2、。腎病模型為研究對(duì)象,應(yīng)用纈沙坦進(jìn)行干預(yù),分別檢測(cè)HIF-1α、TIMP-1、MMP-9在腎間質(zhì)中mRNA的表達(dá)變化,并結(jié)合尿蛋白定量及腎功能等其他生化指標(biāo),進(jìn)而闡明DN間質(zhì)纖維化的發(fā)生機(jī)制,同時(shí)為臨床應(yīng)用ARB類藥物(纈沙坦)治療糖尿病腎病提供理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 健康雄性SPF級(jí)Sprague—Dawley(SD)大鼠54只,體質(zhì)量180～220 g,由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為正常對(duì)照組(C組,18

3、只)、糖尿病腎病模型組(D組,18只)和纈沙坦治療組(T組,18只)。動(dòng)物禁食12小時(shí),D組、T組大鼠采用鏈尿佐菌素(STZ)以60mg／kg一次性單側(cè)腹腔注射制備糖尿病腎病大鼠模型,C組動(dòng)物注射等量的緩沖液。穩(wěn)定3天后尾靜脈采血測(cè)定血糖,將血糖大于16.7mmol／L為DM模型動(dòng)物造模成功。普通飲食繼續(xù)喂養(yǎng)3周,用金屬代謝籠收集24小時(shí)尿液后,用磺基水楊酸法,并行空白對(duì)照測(cè)定24小時(shí)尿蛋白排泄量,當(dāng)24小時(shí)尿蛋白定量≥30mg時(shí)確認(rèn)D

4、N大鼠模型成功。造模后T組大鼠給予纈沙坦混懸液按40mg／kg·d一次性灌胃,C組和D組大鼠給予同等體積蒸餾水灌胃,分別于4周、8周、12周時(shí)測(cè)體重、血糖、血肌酐、血漿白蛋白；收集24小時(shí)尿標(biāo)本進(jìn)行尿蛋白定量；腎臟稱重,計(jì)算腎臟指數(shù)(腎重／體重)腎組織進(jìn)行石蠟切片、Masson染色、免疫組織化學(xué)法測(cè)定HIF-1α、TIMP-1、MMP-9在腎組織的表達(dá)變化,RT—PCR測(cè)定上述三因子的mRNA的表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)期間自由飲水、進(jìn)食,不使用胰

5、島素及其他降糖藥物。
　　 結(jié)果：
　　 1實(shí)驗(yàn)室檢查
　　 DN大鼠造模成功后,D組T組大鼠的血糖即明顯高于C組(P<0.05),且在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中,血糖持續(xù)在高水平(見表1)。C組大鼠血糖、血漿白蛋白、24小時(shí)尿蛋白定量、腎臟指數(shù),血肌酐從4周到12周無(wú)明顯差別,D組大鼠血漿白蛋白、24小時(shí)尿蛋白定量、腎臟指數(shù)、血肌酐與同時(shí)間C組相比有顯著差異(P<0.05),在8周末、12周末T組大鼠24小時(shí)尿蛋白定量、腎

6、臟指數(shù),血肌酐顯著低于相應(yīng)D組,血漿白蛋白高于D組(P<0.05)(見表2—5)
　　 2.免疫組化
　　 正常對(duì)照組HIF-1α、TIMP-1在腎間質(zhì)及腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)極少量表達(dá),MMP-9表達(dá)呈陽(yáng)性。D組及T組中HIF-1α,TIMP—1與MMP-9均表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞的胞漿中,8周與12周時(shí),T組與D組相比較,TIMP—1與HIF-1α表達(dá)相對(duì)減少,MMP-9表達(dá)相對(duì)增多。
　　 3.Masson染色

7、r>　　 D組、T組大鼠腎間質(zhì)膠原相對(duì)面積(Masson染色腎間質(zhì)藍(lán)染區(qū)面積與視野面積的比值)明顯高于C組(P<0.05),從8周起T組腎間質(zhì)膠原相對(duì)面積低于D組(P<0.05)。(見表6,圖4.1-4.9)
　　 4.RT—PCR技術(shù)
　　 C組HIF-1α、TIMP-1、MMP-9mRNA表達(dá)在4周、8周、12周無(wú)明顯變化(p>0.05)。D組、T組HIF—1α、TIMP-1mRNA的表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組(P<0

8、.05),并隨時(shí)間的變化逐漸增加,在8周、12周時(shí)T組的表達(dá)水平低于相應(yīng)D組(P<0.05)；D組、T組MMP-9mRNA的表達(dá)明顯低于C組(P<0.05),并隨時(shí)間的變化逐漸減少,在8周、12周時(shí)T組的MMP-9mRNA表達(dá)水平高于相應(yīng)D組(P<0.05)。(見圖A、1、2、3)
　　 5.相關(guān)性分析:糖尿病大鼠模型中HIF-1α,TIMP-1與腎間質(zhì)纖維化(RIF)面積及血肌酐成正相關(guān),MMP-9與腎間質(zhì)纖維化(RIF)面積