重組人細胞色素P450酶催化氟西汀立體選擇性代謝研究.pdf

1、本課題首先采用實驗室已有質(zhì)粒表達獲得了人CYP2C9(*1,*3,*13,*16),CYP2C8(*1,*2,*3,*4),CYP2C19(*11,*2)和CYP2D6*1重組酶;建立了基于穩(wěn)定同位素標記質(zhì)譜識別技術(shù)的氟西汀(Fluoxetine,Fix)及其代謝物諾氟西汀(Norfluoxetine,Nflx)的手性LC-MS/MS分析方法;考察了11個重組酶亞型催化氟西汀代謝的立體選擇性。
　　 1人重組酶在Sf9細胞中的表

2、達和活性鑒定
　　 目的通過桿狀病毒-昆蟲表達系統(tǒng)表達人CYP2C9(*1,*3,*13,*16),CYP2C8(*1,*2,*3,*4),CYP2C19(*1,*2)和CYP2D6*1重組酶,并在蛋白表達水平和活性水平進行鑒定。
　　 方法從實驗室已保存的DH10Bac-pFastbac-CYP2C9(*1,*3,*13,*16),DH10Bac-pFastbac-CYP2D6*1,DH10Bac-pFastbac-C

3、YPOR,DH10Bac-pFastbac-CYPB5等菌中分別提取重組粘粒(Bacmid-CYP2C9*1,*3,*13,*16,Bacmid-CYP2D6*1,Bacmid-CYPOR,Bacmid-CYPB5),轉(zhuǎn)染Sf9細胞,產(chǎn)生重組桿狀病毒,擴增得到的較高滴度的病毒。通過熒光定量PCR測定其滴度后,利用靶病毒和OR,B5病毒共同感染Sf9細胞獲得野生型和突變體重組酶(CYP2C8和CYP2C19直接利用實驗室已有靶病毒表達重組

4、酶)。采用Westernblot檢測重組酶在蛋白質(zhì)水平的表達。利用重組酶與各自經(jīng)典底物共孵育孵育,LC-MS法檢測代謝產(chǎn)物確定重組酶的活性。
　　 結(jié)果Westernblot檢測到55kD左右有清晰條帶出現(xiàn),與重組酶預(yù)期大小一致,表明目的蛋白在細胞中得到良好表達。與經(jīng)典底物共孵育實驗表明重組酶活性良好。
　　 結(jié)論所述各種重組酶均在Sf9細胞得到成功表達,代謝活性良好,可用于后續(xù)體外代謝實驗。
　　 2立體選擇性

5、定量分析Fix和Nflx對映體方法的建立
　　 目的建立一個靈敏,快速,可高通量選擇性定量測定Fix及其去甲基化代謝產(chǎn)物Nflx的方法,用于生物樣本(體外孵育液)中Flx及代謝產(chǎn)物Nflx的檢測,進而考察重組酶催化氟西汀的體外代謝情況。
　　 方法利用質(zhì)譜高靈敏度和選擇性的特點,結(jié)合穩(wěn)定同位素標記技術(shù),開發(fā)可同時選擇性定量分析Flx對映體及其代謝產(chǎn)物Nflx對映體的LC-MS/MS方法。
　　 結(jié)果方法學驗證實驗

6、結(jié)果表明,此法對R-Flx在1～1000ng·mL-1,s-Flx-d5在1～1000ng·mL-1,R-Nflx在0.1～100ng·mL-1,S-Nflx-d5在0.1～100ng·mL-1內(nèi)線性關(guān)系皆良好(R^2＞0.999),R-Flx定量限1ng·mL-1(S/N＞10,RSD=5.5％),S-Flx-d5定量限1ng·mL-1(S/N＞10,RSD=6.1%),R-Nflx定量限0.1ng·mL-1(S/N＞10,RSD=6

7、.5%),S-Nflx-d5定量限0.1ng·mL-1(S/N＞10,RSD=7.6%),方法回收率在96.9%～109.2%,日內(nèi)、日間精密度RSD均＜10%。
　　 結(jié)論建立的LC-MS分析方法靈敏、準確、專屬性強,可用于Flx及其代謝產(chǎn)物Nflx對映體在孵育生物樣本中的定量檢測。
　　 3Flx體外孵育代謝研究
　　 目的測定所得各種人重組酶催化R,S和±Flx的酶動力學參數(shù),考察CYP2C9催化下單映體R

8、和S-Flx之間的相互作用。
　　 方法在優(yōu)化過的孵育時間和酶濃度條件下,將一系列濃度的R,S和±Flx分別與重組酶共孵育,以代謝產(chǎn)物Nflx生成速率對底物濃度作圖,計算酶動力學參數(shù)。選定R-Flx或S-Flx的濃度,選用一系列不同濃度其對映體,與CYP2C9重組酶共孵育,測定由R或S-Flx生成代謝產(chǎn)物的速率,以不加其對映體代謝產(chǎn)物生成量為100%,加入其對映體后生成量占不加的百分含量為縱坐標,所加對映體濃度對數(shù)為橫坐標作圖,

9、考察兩者之間的關(guān)系(計算IC50)。
　　 結(jié)果采用GraphadPrism軟件,以Michaelis-Menten模型或底物自身抑制模型對數(shù)據(jù)進行擬合分析,獲得酶動力學參數(shù)(詳細參見4.3部分)。CYP2C19*1,CYP2D6*1,CYP2C9*1,CYP2C8*1催化±Flx,R-Flx和S-Flx的代謝,Km如下:CYP2C19*1為7.3±1.1μM,3.8±0.4μM,13.5±1.3μM,CYP2D6*1為8.1±

10、1.0μM,4.2±0.7μM,7.5±1.2μM,CYP2C9*1為43.4±6.2μM,92.2±29.3μM,1660±359.4μM,CYP2C8*1為394.8±84.0μM,153.8±32.6μM,195±37.9μM;清除率Clint如下:CYP2C19*1為16.9,29.3,7.1mL·min-1·mg-1protein,CYP2D6*1為2.1,4.3,2.2mL·min-1·mg-1protein,CYP2C9*

11、1為2.86*10-2,1.89*10-2,7.4*10-4mL·min-1·mg-1protein,CYP2C8*1為3.52*10-2,3.95*10-2,3.44*10-2mL·min-1·mg-1protein;CYP2C9(*1,*2,*3,*13,*16)和CYP2C19*1有底物自身抑制現(xiàn)象,Ksi分別為451.3±84.5μM,154.2±34.51μM,173.6±44.4μM,664.1±74.8μM,690.8±2

12、22.4μM;CYP2C9*1,*2,*3,*13,*16催化氟西汀代謝清除率R/S比值分別為25.5,13.4,15.4,6.6,15.6,CYP2C19*1為4.1,CYP2C19*2為3.1,CYP2D6為2.0,CYP2C8*1,*2,*3,*4分別為1.15,1.03,1.43,1.18。對各種重組酶突變體和野生型清除率的比較,突變體*3,*13和*16代謝氟西汀的清除率分別是野生型的33%、19%、57%(±Flx),46%

13、、25%、60%(R-Flx),76%、96%、98%(S-Flx);突變體CYP2C19*2是野生型的的27%(±Flx),25%(R-Flx)和34%(S-Flx);突變體CYP2C8分別是野生型的95%,212%,36%(±Flx),88%,338%,53%(R-Flx),98%,272%,51%(S-Flx)。CYP2C9(*1,*2,*3,*13,*16)催化的對映體相互作用,R-Flx對S-Flx的IC50值分別為21.2μ

14、M,6.3μM,＞57.8μN,＞57.8μM,21.2μM,而S-Flx對R-Flx的IC50均大于57.0μM.
　　 結(jié)論重組酶CYP2C9,CYP2C19,CYP2C8,CYP2D6均能催化Flx的去甲基化代謝,CYP2C19和CYP2D6與氟西汀的親和力更強,CYP2D6對S型氟西汀的親和力最強可能是其主要負責代謝S-Flx的原因之一,CYP2C19和CYP2D6的Clint遠大于CYP2C9和CYP2C8,CYP2D

15、6含量很低,提示CYP2C19是催化氟西汀代謝最為重要的酶之一。重組酶CYP2C19*1和CYP2C9(所有亞型),存在底物自身抑制現(xiàn)象,提示長期服藥時,其他不被抑制的酶(如CYP2C8)參與氟西汀代謝的貢獻可能會增加。CYP2C9,CYP2C19和CYP2D6催化氟西汀的代謝呈現(xiàn)不同程度的立體選擇性差異,優(yōu)先代謝R-Flx,CYP2C8無明顯差異。CYP2C9差異最為明顯,可能是主要負責立體選擇性代謝的酶。CYP2C9和CYP2C19