家蠶細胞色素P450和羧酸酯酶家族基因的鑒定與功能研究.pdf

1、鱗翅目昆蟲的許多成員是重要的農林害蟲，每年給全世界農林業(yè)造成難于估量的損失。由于殺蟲劑的廣泛使用，許多害蟲都產生了不同程度的抗藥性，給防治工作帶來了極大的困難。 細胞色素P450是血紅蛋白的超家族，對多樣的外源化合物和內源化合物的氧化代謝起作用。在昆蟲中，已有大量研究表明細胞色素P450酶系對菊酯類殺蟲劑以及植物毒素的解毒代謝方面起著非常重要的作用。羧酸酯酶屬于α/β水解酶折疊蛋白，組成一個多基因超家族。它能有效催化含羧基酯鍵，

2、酰胺鍵和硫酯鍵的內源性與外源性多種化合物的水解。在昆蟲中，關于羧酸酯酶的研究主要是集中于其在殺蟲劑抗性中的作用。此外，已有許多研究表明許多代謝酶類如細胞色素P450和羧酸酯酶都參與了對氣味信號分子的降解作用。 家蠶是繼果蠅和岡比亞按蚊等昆蟲之后又一個全基因組測序昆蟲，是國際鱗翅目基因組協(xié)會確定的鱗翅目昆蟲的模式昆蟲，而且也是目前唯一的全序列測序鱗翅目昆蟲。大量的基因組信息和EST數(shù)據(jù)庫為利用生物信息學方法研究新基因及其功能提供了

3、非常大的便利。家蠶和野桑蠶具有共同的起源，同鱗翅目蠶蛾科昆蟲。由于農藥對其選擇壓力的不同，家蠶和野桑蠶對農藥的抗性存在差異。對與解毒代謝和嗅覺檢測相關的細胞色素P450和羧酸酯酶家族基因的研究，可以為鱗翅目等害蟲的防治提供借鑒，同時也為研究這兩大家族基因在昆蟲中所起的生理功能，以及馴化條件下物種進化差異研究提供參考。 本研究利用生物信息學和分子生物學技術從家蠶中鑒定了多個細胞色素P450和羧酸酯酶基因，從分子水平上分析了這些基因

4、的進化關系，研究了基因組織表達特性和發(fā)育特性，以及外源毒素對這些基因的誘導表達作用；利用昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)表達了部分基因，并對1個羧酸酯酶基因進行了活性鑒定；首次研究比較了家蠶和野桑蠶酯酶在生化和分子水平上的差異，并從農業(yè)害蟲棉鈴蟲中克隆了第一個羧酸酯酶基因。 1．家蠶細胞色素P450基因的研究 本文利用生物信息學和RT-PCR方法從家蠶中克隆了2個CYP4和4個CYP6家族基因序列。序列分析表明這些基因都具有P450

5、基因保守特征位點，而且都在相同位置含有一個保守的內含子/外顯子結合位點。CYP4M5和CYP4M9在基因組上以head-to-tail的方式成簇排列，可能是通過基因復制產生的。BLAST結果表明這些P450s與主要參與外源物代謝解毒作用的其他昆蟲CYP4和CYP6家族成員同源性較高。RT-PCR分析表明這6個P450基因都在中腸或脂肪體中高表達，基因不同發(fā)育階段表達分析表明它們具有類似或完全不同的表達調控模式。在人工飼料中添加1．75×

6、10-5％和3．5×10-6％的氯氰菊酯(cypermethrin)，以及0．1％蕓香苷(rutin)后，CYP6AB5表達量分別升高了2．3倍，2．2倍和1．9倍；而添食0．1％(槲皮素)quercetin后CYP6AB5表達量基本不變。與此相反，其他5個基因的表達反而都受到不同程度的抑制。我們利用昆蟲Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)表達了CYP6AB5基因。該基因的表達為進一步構建體外代謝酶系，檢測該基因的底物特異性打下了基礎。

7、 信號失活是嗅覺動態(tài)過程的一個重要步驟，這一過程包括多樣的氣味降解酶類。本文利用RT-PCR方法從家蠶蛾的觸角中克隆了另一個新的細胞色素P450基因CYP6AE21。該基因含有一個1572 bp的ORF，編碼一個推定的523個氨基酸的蛋白質。CYP6AE21推定的分子量為60．5 kD，等電點為8．4，含有一個細胞色素P450的特征序列血紅素結合位點區(qū)域。CYP6AE21和家蠶CYP6AE2基因一樣在相同位置含有1個內含子序列，

8、且相應的2個外顯子大小完全一致。它們之間的核苷酸序列相似性達到94．5％，且在基因組上以head-to-tail的方式成簇排列，中間由約7．6 kb核苷酸序列隔開，推測它們是由其中一個基因加倍復制形成的。CYP6AE21在幼蟲的頭部和脂肪體，以及蛾的觸角中表達量非常高；在幼蟲和蛾的多個其他組織中也都有表達。P450酶系的重要組分之一細胞色素P450還原酶基因(CPR)也在雌蛾和雄蛾觸角中高表達，在其它組織中都有表達，但表達量相對較低。亞

9、細胞定位分析表明CYP6AE21表達產物定位于細胞質中，與微粒體P450經典的定位一致。推測此P450基因可能主要參與內化進細胞后的氣味分子的降解清除作用。 2．家蠶和野桑蠶羧酸酯酶家族基因的研究 羧酸酯酶屬于α/β水解酶折疊蛋白，它能有效催化含羧基酯鍵，酰胺鍵和硫酯鍵的內源性與外源性多種化合物的水解。關于昆蟲羧酸酯酶的研究主要集中于與殺蟲劑抗性的關系，而與其生理功能相關的研究比較少。本文用生物信息學方法篩選家蠶基因組數(shù)

10、據(jù)，并通過分子手段從家蠶中鑒定了12個候選的羧酸酯酶基因序列。其中2個羧酸酯酶基因能通過選擇性剪切產生多個不同的剪切變體。部分羧酸酯酶基因在同一染色體上成簇排列，其他多數(shù)基因都分散分布在不同的染色體上。根據(jù)內含子數(shù)目可以將這些基因分成兩類，其中I類基因相應的內含子位點非常保守，II類基因則差異較大。同源比較和進化分析表明家蠶的羧酸酯酶之間總體差異較大，家族基因內部可能經歷了較大的進化分歧。表達分析表明這些羧酸酯酶基因具有多樣的組織表達特

11、性，其中一些基因在幼蟲的中腸或絲腺中高表達，一些在蛾觸角中高表達。此外，2個基因BmCarE-12和BmCarE-15在幼蟲脂肪體中能被脂多糖(LPS)誘導后表達升高。本研究根據(jù)這些羧酸酯酶基因相應的表達圖譜和進化關系對它們可能參與的功能作用進行了探討。 家蠶BmCarE-5基因在幼蟲的中腸，以及在成蟲的觸角等組織中都高表達。啟動子分析表明該基因可能受內源激素的調控。為了進一步研究此基因的功能特性，我們利用昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)分

12、別表達了這兩個基因。SDS-PAGE分析表明經BmCarE-5基因重組bacmid感染后的BmN細胞與對照組相比在預期的76 kD左右大小位置有一條特異條帶。Western blot分析表明在預期的同樣大小位置有一條特異條帶，進一步表明BmCarE-5得到了成功表達。此基因表達產物經純化后，進行了酶活性檢測。結果表明此酶的最適溫度為40℃，Km和Vmax大小分別為2．653 mM和178OD/min·mg protein。本研究為進一步

13、闡明羧酸酯酶基因可能參與的生理功能提供了借鑒。 為了研究酯酶與野桑蠶Bombyx mandarina和家蠶對殺蟲劑抗性差異的關系，以及家蠶和野桑蠶酯酶家族基因的進化差異，采用動力學方法檢測了家蠶和野桑蠶幼蟲不同發(fā)育階段，以及5齡第3 d幼蟲不同組織的酯酶活性。家蠶和野桑蠶酯酶活性都在幼蟲末期較高，且都具有類似的組織分布模式，在中腸中活性最高，絲腺次之，表明家蠶和野桑蠶的酯酶在進化上是相對較保守的。家蠶中腸酯酶活性是野桑蠶的1．9

14、7倍，根據(jù)“脂族酯酶突變假說”，推測野桑蠶殺蟲劑抗性不是由于酯酶基因過量表達，而是由于點突變或者是由其他解毒酶系差異造成的。BmmCarE-4和BmmCarE-5共含有7個不同的選擇性剪切變體，選擇性剪切發(fā)生在5’端。這2個基因都存在于同一個轉錄單元上，且推定的氨基酸序列同源性達52％以上。其中BmmCarE-4和BmmCarE-5與家蠶相應的同源基因一樣是由其中一個基因通過3’端基因序列加倍復制形成的，進一步表明家蠶和野桑蠶酯酶在分子

15、水平上是相當保守的。絲腺酯酶活性是野桑蠶的4．49倍，其中CarE-9基因在家蠶和野桑蠶絲腺中表達量基本無差異，而CarE-7在家蠶絲腺中高表達，在野桑蠶中則幾乎不表達。表明CarE-7基因在家蠶和野桑蠶絲腺中的差異表達是絲腺組織活性差異的主要原因之一，初步推測其可能在絲腺的生長發(fā)育或蠶絲合成等方面起著重要的作用。此外，野桑蠶羧酸酯酶基因BmmCarE-2與家蠶羧酸酯酶基因BmCarE-2(GenBank登錄號：DQ311250)的氨基

16、酸序列相似性最高，達98．9％。組織表達分析表明BmmCarE-2在頭部和脂肪體表達量較高，在絲腺和中腸稍低，而在血液中表達量最低。 3．棉鈴蟲羧酸酯酶基因的研究 為了從分子水平上研究棉鈴蟲Helicoverpa armigera對殺蟲劑抗性的產生機理，本文通過RT-PCR和RACE方法首次從棉鈴蟲中腸中克隆了一個羧酸酯酶全長cDNA序列。序列分析表明，該基因包含一個1794 bp的開放讀碼框，129 bp的5'UTR和