皮膚細(xì)胞色素P450酶的表達(dá)調(diào)控及相關(guān)藥物代謝研究.pdf

1、皮膚是人體最大的器官，是機(jī)體和外界之間的天然屏障，可防止外界有害物質(zhì)的入侵，也是藥物經(jīng)皮吸收的給藥部位。皮膚表達(dá)有多種代謝酶，是肝外藥物代謝的主要器官之一。細(xì)胞色素P450酶系(cytochromeP450，CYP)是一組含亞鐵血紅素的酶，參與了許多內(nèi)源性物質(zhì)如類固醇、脂肪酸、膽酸、維生素D3、前列腺素、兒茶芬胺和許多進(jìn)入體內(nèi)的外源性物質(zhì)如藥物、殺蟲劑、毒物、致癌物的代謝。涉及藥物代謝的CYP酶系主要有CYPl、CYP2和CYP3三個(gè)家

2、族。各類CYP酶在維持皮膚的正常生理功能和保持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定方面發(fā)揮著重要的作用。研究皮膚中的CYP酶的表達(dá)特點(diǎn)有助于明確藥物的經(jīng)皮吸收機(jī)理和藥物在皮膚的代謝過(guò)程，從而對(duì)提高藥物治療效果、開發(fā)經(jīng)皮給藥新制劑、防止藥物和毒性物質(zhì)對(duì)皮膚的侵害等，具有重要意義。 近年來(lái)，皮膚CYP酶的研究已成為皮膚藥理學(xué)的研究熱點(diǎn)。一方面皮膚是過(guò)敏和炎癥的頻發(fā)部位，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等參與了皮膚過(guò)敏、炎癥和免疫反應(yīng)。探討病理因素在皮

3、膚CYP酶表達(dá)調(diào)節(jié)中的作用，為探索皮膚疾病的發(fā)病機(jī)制及臨床治療提供新靶點(diǎn)。另一方面，各種皮膚疾病的治療離不開藥物，而這些治療藥物又是多種CYP酶的底物，探討皮膚CYP相關(guān)的藥物代謝，有助于合理選擇治療藥物，減少藥物不良反應(yīng)。 本研究首先建立了用于檢測(cè)皮膚多種CYP酶表達(dá)的免疫組化和RealtimePCR方法，考察了角質(zhì)形成細(xì)胞和健康人皮膚組織CYP的表達(dá)特點(diǎn)。采用OligoGEArray(R)毒理與藥物耐受基因芯片檢測(cè)銀屑病患者

4、皮損組織和經(jīng)組胺刺激的HaCaT細(xì)胞CYPmRNA的表達(dá)改變，RealtimePCR法定量檢測(cè)CYP酶在HaCaT細(xì)胞中的表達(dá)調(diào)控，考察了細(xì)胞因子TNFα，IL-2，IL-6，IFNγ對(duì)CYPmRNA表達(dá)的影響，研究了地塞米松和苯巴比妥對(duì)CYP的誘導(dǎo)作用。選擇右美沙芬為CYP2D6的探針?biāo)幬?，采用LC/MS/MS方法檢測(cè)代謝產(chǎn)物去甲基右美沙芬的轉(zhuǎn)化量，研究其在大鼠皮膚勻漿中的代謝過(guò)程，并與肝勻漿代謝比較，來(lái)考察大鼠皮膚CYP2D6酶活性

5、和特比萘芬對(duì)CYP2D6的抑制作用。 第一部分免疫組化法檢測(cè)CYP在HaCaT細(xì)胞和健康人皮膚組織中的表達(dá) 采用免疫組化方法檢測(cè)了涉及藥物代謝的CYP1，2，3系列的5種CYP酶(CYP1A1，CYP1A2，CYP2C9/19，CYP2D6，CYP3A4)在HaCaT細(xì)胞和健康人皮膚組織中的表達(dá)，結(jié)果表明： 1.健康人皮膚組織均可見(jiàn)5種CYP酶的棕黃色陽(yáng)性表達(dá)，但表達(dá)強(qiáng)度存在差異，以CYP2C9/19，CYP2D

6、6和CYP3A4表達(dá)較強(qiáng)，CYP1A1次之，CYP1A2較弱。表達(dá)部位主要集中在表皮，以靠近皮膚外側(cè)的角質(zhì)層更為明顯，皮脂腺、小汗腺和毛囊等皮膚附屬器及淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等也有多種CYP酶表達(dá)。 2.HaCaT細(xì)胞和肝L02細(xì)胞均可見(jiàn)棕黃色陽(yáng)性表達(dá)，L02細(xì)胞較HaCaT細(xì)胞表達(dá)更顯著。HaCaT細(xì)胞各種CYP酶的表達(dá)強(qiáng)度存在差異，以CYP1A1最強(qiáng)，其它均較弱；L02細(xì)胞各種CYP酶的表達(dá)強(qiáng)度差異不明顯。 第二部分Re

7、altimePCR法定量檢測(cè)CYPmRNA在HaCaT細(xì)胞和健康人皮膚組織中的表達(dá) 建立了同一體系下定量檢測(cè)CYP1A1，CYP1A2，CYP1B1，CYP2C9，CYPC19，CYP2E1，CYP2D6和CYP3A4八個(gè)CYP基因mRNA表達(dá)的RealtimePCR方法，并應(yīng)用于健康人皮膚組織和HaCaT細(xì)胞的CYPmRNA檢測(cè)，結(jié)果表明： 1.CYP1A1，CYP1A2，CYP1B1，CYP2C9，CYP2C19，C

8、YP2E1，CYP2D6和CYP3A4均可在健康人皮膚組織中檢測(cè)到，以CYP1A1，CYP1B1，CYP2C19，CYP2E1，CYP2D6表達(dá)水平較高，CYP1A2和CYP3A4表達(dá)水平較低。 2.包皮組織檢測(cè)結(jié)果顯示上述CYPmRNA表達(dá)具有較大的個(gè)體差異，其中CYP1A1個(gè)體差異最大，最低和最高表達(dá)量之間相差115.36倍。包皮組織與其它部位相應(yīng)CYPmRNA表達(dá)相比，CYP2C9，CYP2C19，CYP2E1和CYP3A

9、4存在顯著性差異(P＜0.05)，CYP1A1和CYP2D6無(wú)顯著性差異(P＞0.05)；頭頸部皮膚組織與四肢軀體部位相比，僅CYP1A1mRNA表達(dá)存在顯著性差異(P＜0.05)，CYP1A2，CYP2C9，CYP2C19，CYP2E1，CYP2D6和CYP3A4mRNA均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。 3.HaCaT細(xì)胞CYPmRNA表達(dá)水平總體與健康人皮膚組織一致，CYP1A2和CYP3A4表達(dá)較皮膚組織低。 第三

10、部分銀屑病患者皮損組織CYP的芯片檢測(cè) 采用OligoGEArray(R)毒理與藥物耐受基因芯片檢測(cè)銀屑病患者皮損組織CYP酶mRNA表達(dá)情況(共23種)，并與健康皮膚組織比較，CYP1A1，CYP1A2，CYP1B1，CYP3A5mRNA上調(diào)22.99％～32.76％;CYP24A1，CYP26B1，CYP2A6，CYP2C8，CYP2C9，CYP2D6，CYP2E1下調(diào)21.77％～45.08％。結(jié)果表明，CYP酶在銀屑病患

11、者皮損組織表達(dá)發(fā)生了改變，這種改變可能與銀屑病的發(fā)病機(jī)制及局部皮損組織的免疫環(huán)境改變有關(guān)。與健康人基因表達(dá)相比，NOS上調(diào)了2.67倍，使NO水平顯著高于正常，NO可能參與了CYP的表達(dá)調(diào)控。 第四部分組胺刺激HaCaT細(xì)胞后CYP的芯片檢測(cè) 以組胺刺激HaCaT細(xì)胞，在體外模擬皮膚炎癥狀態(tài)，采用OligoGEArray(R)毒理與藥物耐受基因芯片檢測(cè)細(xì)胞CYPmRNA表達(dá)情況，通過(guò)與未處理對(duì)照細(xì)胞及H1受體拮抗劑西替利

12、嗪干預(yù)進(jìn)行比較，探討了組胺在CYP酶表達(dá)調(diào)控中的作用，為探索過(guò)敏炎癥發(fā)病機(jī)制及臨床治療提供新靶點(diǎn)。結(jié)果表明組胺僅上調(diào)CYP4B1表達(dá)(22.60％)，并可被西替利嗪逆轉(zhuǎn)；組胺對(duì)CYP11A1，CYP11B2，CYP1A1，CYP1B1，CYP20A1，CYP26B1，CYP2B6，CYP2C8，CYP2C9，CYP2D6，CYP3A5，CYP4A11，CYP4F3下調(diào)20.91％～52.30％;鹽酸西替利嗪是新型H1受體拮抗劑，臨床廣泛

13、用于治療各種過(guò)敏性疾病。西替利嗪對(duì)組胺引起的CYP改變，有不同程度的恢復(fù)作用，說(shuō)明H1受體參與了對(duì)CYP的調(diào)節(jié)，但組胺引起的CYP下調(diào)不能完全被西替利嗪所逆轉(zhuǎn)，說(shuō)明組胺對(duì)CYPmRNA表達(dá)的影響不完全由H1受體介導(dǎo)，可能還存在著其它的調(diào)節(jié)機(jī)制。 第五部分CYP酶在人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中的表達(dá)調(diào)控 采用RealtimePCR法定量檢測(cè)CYP酶在HaCaT細(xì)胞中的表達(dá)調(diào)控，考察了細(xì)胞因子TNFα，IL-2，IL-6，IFNY對(duì)

14、CYPmRNA表達(dá)的影響，研究了地塞米松和苯巴比妥對(duì)CYP的誘導(dǎo)作用。結(jié)果表明，TNFα，IL-6，IFNY對(duì)CYP2D6和CYP2E1的表達(dá)無(wú)明顯影響(P＞0.05)。20和100ng/ml濃度的IL-2校正CT值為11.86±0.53和11.62±0.32，與對(duì)照細(xì)胞校正CT值為10.53±0.14相比均有顯著性差異(P＜0.05)。20和100ng/ml的IL-2可分別使CYP2D6mRNA的表達(dá)下降到對(duì)照細(xì)胞的2.51和2.13

15、倍。但I(xiàn)L一2對(duì)CYP1A1mRNA無(wú)明顯影響(P＞0.05)。與肝CYP研究結(jié)果一致，地塞米松可誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞CYP3A4mRNA的表達(dá)，與對(duì)照組相比均有顯著性差異(P＜0.05)。2×10-6M，1×10-5M和5×10-5M濃度的地塞米松分別使CYP3A4mRNA的表達(dá)增加到11.16，10.63和18.63倍；5×10-4M的高濃度苯巴比妥可以誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞CYP2C9mRNA的表達(dá)，與對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.0

16、5)。 第六部分皮膚右美沙芬經(jīng)CYP2D6代謝與特比萘芬的抑制作用 采用右美沙芬為探針?biāo)幬?，將右美沙芬加入至皮膚勻漿中進(jìn)行37C孵育，通過(guò)建立測(cè)定皮膚勻漿中右美沙芬代謝產(chǎn)物去甲基右美沙芬濃度的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)。通過(guò)測(cè)定去甲基右美沙芬的生成量及速度，來(lái)研究皮膚CYP2D6酶的活性，結(jié)果表明肝勻漿和皮膚勻漿均有CYP2D6的功能表達(dá)，能夠?qū)⒂颐郎撤肄D(zhuǎn)化為去甲基右美沙芬，但皮膚勻漿中轉(zhuǎn)化的量少。