武夷菌素發(fā)酵條件的優(yōu)化及效價的測定.pdf

1、武夷菌素是從不吸水鏈霉菌武夷變種(Streptomyces ahygroscopicus.var．wuyiLensis)發(fā)酵產(chǎn)物中提取研制出的一種具有廣譜抗菌作用的農(nóng)用抗生素，對多種作物病原真菌有較強抑制作用。為了提高鏈霉菌產(chǎn)生武夷菌素的效價，本研究對不吸水鏈霉菌的培養(yǎng)條件和發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，并建立了高效液相色譜法測定發(fā)酵液中武夷菌素含量的技術(shù)。 1. 對不吸水鏈霉菌產(chǎn)生武夷菌素原有的最佳發(fā)酵條件進行了驗證和改進：發(fā)酵起始pH

2、值為8.0，溫度為25～28℃，使用菌種的種齡為18～24h，這與之前采用的發(fā)酵條件相近。發(fā)酵時間由原來的48h延長到64h。采用原有的培養(yǎng)基配方進行檢驗，使用原來條件和優(yōu)化后條件發(fā)酵，武夷菌素的效價分別為3515μg/mL和4443μg/mL，可以提高26.4﹪。 2．首先應(yīng)用替代法篩選出淀粉、葡萄糖、玉米粉、豆餅粉、化合物A、B和C、MgSO<,4>、FeSO<,4>、NaCl為武夷菌素發(fā)酵較適宜的碳、氮源和微量元素。然后應(yīng)

3、用部分因子設(shè)計法對以上10種營養(yǎng)成份進行了分析，確定葡萄糖和豆餅粉為影響武夷菌素效價的關(guān)鍵因子，最后通過最陡爬坡實驗逼進最大響應(yīng)區(qū)域，用中心組合設(shè)計法優(yōu)化葡萄糖(X<,2>)和豆餅粉(x<,4>)的濃度，得到武夷菌素效價(y)的二次多項式優(yōu)化擬合模型，其為：y=6643.78+687.42x<,2>+275.13x<,4>-824.69x<,2><'2>-122.45x<,2>x<,4>-620.94x<,4>(R=0.8999，P<0

4、.01)。 由該模型求解可知，當葡萄糖27.2g/L、豆餅粉31.8g/L時武夷菌素效價(y)有最大值。于是按這兩種關(guān)鍵因子的用量配制出優(yōu)化培養(yǎng)基，用菌株S-40(原始效價4443μg/mL)比較試驗測定表明，在這種優(yōu)化的培養(yǎng)基上武夷菌素的效價可提高到6643μg/mE，即提高約50﹪3．將配置好的武夷菌素標準品樣品，在200～400nm吸收波長范圍內(nèi)用紫外掃描儀掃描，發(fā)現(xiàn)最大吸收峰在254nm。在進樣量20μL，流速1.0mL

5、/min和柱溫25℃條件下，先后以純水、乙腈、三氟乙酸、乙酸銨和三氯乙酸的水溶液為流動相進行分離，發(fā)現(xiàn)當三氯乙酸在1.4g/L時(pH<'->2.0)效果最好。考慮到pH對色譜柱的影響，純水流動相引起色譜柱塌陷問題以及填料直徑對色譜柱分離效果的影響，最終選擇了填料直徑為5μm耐酸(1

6、272+0.345x(R=0.9994，P<0.01)，這表明在0.2mg/mL～1.6mg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。變異系數(shù)為0.43﹪～2.08﹪，回收率為96.59﹪～100.57﹪，于是建立了應(yīng)用高效液相色譜法檢測武夷菌素有效成份的技術(shù)。 利用管碟法中的“一劑量法”進行武夷菌素效價標準曲線繪制。以不同濃度武夷菌素抑菌圈直徑為橫坐標，濃度的常用對數(shù)值為縱坐標，繪制武夷菌素效價標準曲線，求得回歸方程y=-1.5097+0

7、.1199x(R=0.9948，P<0.01)。結(jié)果表明武夷菌素在20μg/na～μg/mL濃度范圍內(nèi)抑菌圈直徑與濃度的對數(shù)呈直線關(guān)系。 同時通過試驗測定和分析，建立了管碟法與HPLC法測定的武夷菌素含量之問的多元線性模型，并對模型進行了驗證。管蝶法測定的武夷菌素生物效價(y)與用HPLC測得的武夷菌素A、B、C、D組分峰面積之間的多元線性模型為： y=1025.041-0.375A+3.997B-1.072C+0.220D(R