實驗六抗體效價的elisa測定

1、實驗二 酶聯(lián)免疫吸附測定BSA抗體效價 1.目的要求(1)學(xué)習(xí)酶聯(lián)免疫吸附測定的基本原理。 (2)掌握酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)，抗體的效價測定及酶聯(lián)免疫測定儀的使用。,2.基本原理免疫酶技術(shù):酶標(biāo)Ab/Ag,酶結(jié)合物的酶在免疫反應(yīng)后，作用于厎物后顯色，根據(jù)顏色的有無和深淺，定量測定Ab/Ag。免疫反應(yīng)：一次或數(shù)次 具Ag,Ab特異的免疫學(xué)反應(yīng)酶促反應(yīng)：只進行一次 顯示出生物放大作用，靈敏度ng,pg,60年代初

2、期，Averameas & Ram等建立了免疫酶技術(shù)(immunoenzymatic techniques) 利用特殊的交聯(lián)劑研制出辣根過氧化物酶---人血清白蛋白及酸性磷酸酯酶---抗體，統(tǒng)稱為酶標(biāo)記物或酶結(jié)合物，用于抗原或抗體的示蹤、定位或定量測定,酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay簡稱為Elisa)-----是在免疫酶技術(shù)(immunoenzymatic techniq

3、ues)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型的免疫測定技術(shù)。本法兼有靈敏度高和特異性強兩方面的優(yōu)點。,1974年 Voller等用聚苯乙烯微量反應(yīng)板作為免疫吸附劑吸附抗體(抗原)，再與相應(yīng)的酶標(biāo)記物結(jié)合操作更方便，易重復(fù)靈敏度可高達ng（10-9g）至pg(10-12g)，,(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay),免疫標(biāo)記技術(shù),應(yīng)用各種液相和固相免疫分析方法，對體液中的半抗原、抗原或抗體進行定性和定量測定

4、,標(biāo)記抗體或抗原,熒光素、放射性同位素、酶、鐵蛋白、膠體金及化學(xué)(或生物)發(fā)光劑,鏡檢觀察或進行自動化測定,熒光顯微鏡，射線測量儀，酶標(biāo)檢測儀，電子顯微鏡和發(fā)光免疫測定儀等,直接在細胞、亞細胞、超微結(jié)構(gòu)及分子水平上,對抗原抗體反應(yīng)進行定性和定位研究,,,,酶------性能穩(wěn)定、經(jīng)濟易得、底物無色、產(chǎn)物顯色，便于檢測常用的酶:堿性磷酸酯酶、辣根過氧化物酶(horserad peroxidase簡稱HRP)、葡萄糖氧化酶、半乳糖苷酶等。

5、,酶標(biāo)技術(shù),戊二醛法， 過碘酸氧化法將酶與Ab交聯(lián)在一起,Ag-Ab-抗Ab-HRP,,TMB+H2O2,產(chǎn)物（黃色，OD450)+H2O,圖一　　直接型Elisa,,圖二　　間接型Elisa,圖三 雙抗體夾心型ELISA,圖四 固相抗體競爭型ELISA未知抗原量=A（1）-A（2）,每次反應(yīng)后都要反復(fù)洗滌？保證反應(yīng)的定量反應(yīng)防止重疊反應(yīng)，引起非特異現(xiàn)象。,Partially purified, inactivated HIV

6、 antigens antigens pre-coated onto an ELISA platePatient serum which contains antibodies. If the patient is HIV+, then this serum will contain antibodies to HIV, and those antibodies will bind to the HIV antigens on t

7、he plate. Anti-human immunoglobulin coupled to an enzyme. This is the second antibody, and it binds to human antibodies. substrate which changes color when cleaved by the enzyme attached to the second antibody.,HI

8、V (human immunodeficiency virus) detection,positive,negative,Protein protein interaction---ELISA,1. Direct elisa different epitopeCoat with prey proteinIncubate with bait protein Pimary Ab anti bait protein -----

9、,2.Competitive elisa same epitopeCoat with bait prIncubate with primary antibody anti bait pr and various concentration prey protein,,4. 操作方法4.1 包被特異性抗原:固體抗原(如蛋白質(zhì))用包被液稀釋至10Oμg/ml，每凹孔加100μL，加蓋置4℃過夜(37 ℃ 2h)【已完成】

10、 次日傾去凹孔內(nèi)液體，用滴管取洗滌液在每孔中加滿稀釋/洗滌液洗滌3次，首次洗滌靜置2min后傾去，后兩次靜置1min。將反應(yīng)板扣放在濾紙上，以除凈液體。4.2 封閉: 每孔中加滿封閉液（約300ul多），加蓋或用封口膜封板，置37℃恒溫箱60min，傾去孔內(nèi)液體，按上法洗滌3次。,4.3 加待測血清(內(nèi)含抗體)、陰性血清(無抗體)及稀釋液(PBS/Tween):待測血清按倍比法用稀釋液稀釋(1:100、1:200等)，陰性血

11、清也稀釋成1:100，取不同稀釋度的待測血清，陰性血清及稀釋液(PBS/Tween)各1OOμL加至相應(yīng)的凹孔中，加蓋或封板，置37℃恒溫箱1h，使抗體與固相抗原進行特異性結(jié)合，反復(fù)洗滌3次。,,4.4 加酶標(biāo)抗體:加入HRP-抗體(抗抗體，本實驗中已經(jīng)根據(jù)說明書稀釋一千倍)，每孔加l00μL，封板后置37℃溫育lh，按上法至少洗滌5次，最后用蒸餾水洗滌2次，扣在濾紙上吸干水分。4.5 顯色: 首先按每10mLOPD應(yīng)用液加入0.15

12、mLH2O2處理。每孔加入OPD應(yīng)用液1OOuL、反應(yīng)板置室溫暗處5～30min。當(dāng)顯示明顯黃色時應(yīng)及時終止反應(yīng)。4.6 終止反應(yīng):每孔加入10OμL 2mol/L H2SO4。由黃色變?yōu)槌壬７€(wěn)定3～5min即可比色測定。,4.7 檢測: 用酶聯(lián)免疫測定儀，以PBS/Tween孔為對照、測波長為49Onm時各孔光吸收（A）。計算陽性血清與陰性血清A值之比(Positive/negative，P/N)，當(dāng)P/N≥2.1時為陽性，P/

13、N<2.1而≥1.5為可疑，P/N<1.5為陰性。用目測法則以較陰性對照深色的最高稀釋度作為抗體效價。用“＋”“－”表示，超過規(guī)定吸收值（0.2－0.4）的標(biāo)本均屬陽性。,注意事項 (1)聚苯乙烯微量反應(yīng)板應(yīng)選擇高質(zhì)量、非特異性吸附小的產(chǎn)品。包被物應(yīng)具有較高的純度，其濃度一般在1～100μg之間，在偏堿條件下易吸附于反應(yīng)板的凹孔中，4℃放置過夜較理想，若暫時不用，可加入終濃度為0.02% NaN3，4℃貯存，也可傾

14、去包被液，干燥后置硅膠干燥器中，室溫存放3個月以上不影響測定效果。 (2)反應(yīng)各步均應(yīng)充分洗滌，以除去殘留物，減少非特異性吸附。為使結(jié)果重復(fù)應(yīng)固定洗滌次數(shù)及放置時間，切忌相互污染。 (3)為使顯色反應(yīng)便于比較，顯色后置室溫暗處的時間應(yīng)一致，終止反應(yīng)3～5min后應(yīng)立即比色。必要時可設(shè)陽性對照，以固定顯色及終止時間。 (4)待測抗體或抗原與酶標(biāo)抗體應(yīng)具有相同的免疫特異性，否則無法結(jié)合。,自動酶標(biāo)儀（Elx800UV

15、）使用程序1 開機，進行System self-test…2 按“DEFINE”鍵，進入“SELECT ASSAY NUMBER”， 用“NUMERIC”或“OPTION”鍵輸入測試號（注：assay 01 為quick read，最大測試號為55）；按“ENTER”鍵修改測試的“NAME”；再按“ENTER”鍵進入下列菜單：按“METHOD”鍵選擇測試的波長類型（Single或Dual）、波長大小(340、405、450、490

16、或630nm)、微孔板類型(96孔、48孔或24孔)。按“MAP”鍵選擇閱讀方式(Auto或Manual) 、閱讀方向（Down或Across）、重復(fù)方向（Down或Across）、閱讀起始位置（輸入編號）、空白Map（Air、Full、Const、Column、P-Down、P-Across）。,3 按“READ”鍵，酶標(biāo)板推進入儀器，開始讀數(shù)并計數(shù)，打印機輸出數(shù)據(jù)。 4 按“MAIN MENU”鍵回到主菜單，關(guān)閉電源。,酶標(biāo)