實驗一 制霉菌素發(fā)酵、提取與效價測定

1、實驗一實驗一制霉菌素發(fā)酵、提取與效價測定制霉菌素發(fā)酵、提取與效價測定1.實驗目的與要求(1)了解抗生素發(fā)酵的一般過程及發(fā)酵過程中一些重要理化指標檢測方法；(2)學習抗生素（制霉菌素）的提取純化工藝；(3)了解制霉菌素化學效價測定的原理；(4)掌握抗生素生物效價測定的常規(guī)方法——管碟法的原理與操作。2.實驗原理2.1制霉菌素制霉菌素(nystatinmycostatinfungicidin)是由諾爾斯鏈霉菌(Streptomycesnou

2、rsei)產(chǎn)生的一種多烯大環(huán)內酯類一種多烯大環(huán)內酯類(polyenemacrolides)抗真菌抗生素抗真菌抗生素。此類抗生素的結構特點是在分子中既有經(jīng)內酯化作用而閉合的大碳環(huán)，又有一系列的共軛雙鍵。制霉菌素存在于菌絲體中，其純品為淡黃色微細晶體；不溶于水、氯仿和丙酮等；稍溶于低級醇等；溶于吡啶、冰醋酸和NaOH溶液，但均能使其破壞而失效；對較高和較低的pH以及光和熱均不穩(wěn)定。臨床上使用的制霉菌素，其主要成分為制霉菌素A1，化學結構式如

3、下圖所示：它的氨基糖部分是氨基海藻糖，即3氨基36二脫氧D吡喃甘露糖，非糖部分為38員的多烯大環(huán)內酯。制霉菌素對各種真菌如白色念珠菌、隱球菌、莢膜組織胞漿菌及球孢子菌等有抑制作用。主要用于白色念珠菌感染，如消化道念珠菌病、鵝口瘡、念珠菌性陰道炎及外陰炎等。但口服治療全身性真菌感染或深部真菌感染則無效。制霉菌素的作用機理是與真菌細胞膜上的特異甾醇相結合，導致原生質膜破壞，制霉菌素的作用機理是與真菌細胞膜上的特異甾醇相結合，導致原生質膜破壞

4、，“藥品生產(chǎn)管理規(guī)范”（即GMP）的規(guī)定。抗生素精制可選用的步驟有：脫色和去熱源質、結晶和重結晶、共沸蒸餾法、柱層析法、鹽析法、中間鹽轉移法和分子篩等。2.3抗生素的效價與測定通常用效價效價來衡量抗生素發(fā)酵液中抗生素含量。抗生素效價測定可采用化學法或生物效價測定法。生物效價測定法有稀釋法、比濁法和擴散法三大類。管碟法是擴散法的一種，是最常用的測定抗生素效價的方法。據(jù)此，效價即可視為用抗菌效力表示的抗生素的有效含量。管碟法就是在接種有敏感

5、實驗菌的瓊脂平板上放上牛津杯，然后向杯內加滿抗生素溶液，保溫培養(yǎng)一定時間后，抗生素滲透到一定的范圍，抑制敏感菌的生長，產(chǎn)生透明圈。抑菌圈的半徑與抗生素在管中的總量（單位）、抗生素的擴散系數(shù)（cm2h）、擴散時間（即抗生素溶液注入牛津杯至出現(xiàn)抑菌圈所需的時間）、培養(yǎng)基的厚度(mm)和最低抑菌濃度(UmL)等有關?？股乜偭康膶?shù)和抑菌圈直徑的平方呈直線關系。因此，抗生素的效價可以由抑菌圈的大小來衡量。將已知效價的制霉菌素標準液制成標準曲線

6、，比較已知效價標準液與未知效價的被檢溶液的抑菌圈的大小，就可算出樣品中抗生素的效價。3.實驗材料3.1菌種諾爾斯鏈霉菌(Streptomycesnoursei)A94：制霉菌素產(chǎn)生菌；黑曲霉（Aspergillusniger）：制霉菌素敏感菌。3.2培養(yǎng)基（1）孢子斜面培養(yǎng)基：牛肉膏0.28%，飴糖3.5%，蛋白胨0.4%，瓊脂2.0%，pH7.5，121℃滅菌30min，制成斜面。37℃培養(yǎng)2d證明無菌后繼續(xù)在37℃放置直至斜面冷凝水

7、干后取出備用。（可用PDA培養(yǎng)基代替）（2）肉湯培養(yǎng)基：葡萄糖1%，蛋白胨1%，牛肉膏0.6%，NaCl0.5%，pH7.2，每升培養(yǎng)基加1%酚紅溶液0.3mL，121℃滅菌30min，經(jīng)37℃培養(yǎng)2d證明無菌備用。（種子瓶無菌檢查用）（3）細菌瓊脂斜面培養(yǎng)基：葡萄糖1%，蛋白胨1%，牛肉膏0.6%，NaCl0.5%，瓊脂2%，pH7.2，121℃滅菌30min，經(jīng)37℃培養(yǎng)2d證明無菌備用。（種子瓶無菌檢查用）（4）液體種子培養(yǎng)基：淀