PLGA-HA復合支架與異體骨體外細胞相容性的對比實驗研究.pdf

1、實驗目的
　　 研究新型多孔聚乳酸乙醇酸/羥基磷灰石(PLGA/HA)支架材料的體外細胞相容性。采用貼壁法對兔骨髓基質細胞(BMSCs)進行體外礦化誘導培養(yǎng),擴增后與實驗組(含10％HA的PLGA/HA),對照組(異體骨)分別進行體外復合培養(yǎng)；并通過定性及定量法檢測BMSCs在材料表面的粘附能力、增殖活力,驗證細胞材料復合體的成骨活性。比較分析兩組之間的差異。結果顯示兔BMSCs在PLGA/HA及異體骨材料的表面均能生長,經體外

2、誘導后可形成鈣結節(jié),PLGA/HA組細胞的粘附及增殖能力不弱于異體骨組,兩組之間無統計學差異。
　　 實驗材料與方法
　　 抽取3只新西蘭大耳白兔骨髓間充干細胞,經體外分離、培養(yǎng)、擴增、傳代,并純化骨髓間充質干細胞。取經誘導培養(yǎng)的第3代兔BM-SCs,消化后使細胞濃度為1×106/ml。用移液器吸取細胞懸液,分別接種在支架材料與異體骨上,直至飽和。將培養(yǎng)板置于50％CO2培養(yǎng)箱內孵育4h后,按上述方法再接種一次每塊材料上

3、接種細胞約1×105,然后加入誘導培養(yǎng)液浸沒材料,置于5％CO2培養(yǎng)箱內。隔天換液。在倒置相差顯微鏡下,逐日觀察原代和傳代細胞形態(tài)及粘附增殖情況。于接種后4 h,分別取每種材料各2個樣本細胞計數板計算貼壁細胞數[細胞粘附率(％)=貼壁細胞數/接種細胞數×100％]。分別于接種后第3、7天,取出每種材料各2樣本,細胞計數板進行計數,各組取平均值,比較各組細胞增殖情況。分別于聯合培養(yǎng)后第7天與14天,選擇每種材料各2個孔,進行堿性磷酸酶(a

4、lka linephosphatase,ALP)活性定量檢測。配置10μg/ml的鹽酸四環(huán)素,加入原誘導培養(yǎng)液中,抽濾除菌。于聯合培養(yǎng)14 d后,棄原培養(yǎng)液,加入上述液體繼續(xù)培養(yǎng),24h后在熒光顯微鏡下觀察鈣結節(jié)形成情況。
　　 統計學處理,對細胞粘附率及ALP活性的定量進行處理,并進行數據分析。
　　 實驗結果
　　 1 細胞體外培養(yǎng)的觀察BMSCc原代培養(yǎng)約5 d后貼壁生長,逐漸形成克隆,紅細胞通過換液去除,

5、10～12 d匯合,前兩代生長迅速,細胞呈成纖維細胞型,多為梭形和不規(guī)則三角形,細胞排列呈漩渦狀、放射狀。
　　 2 細胞粘附率的測定接種4 h后,每組材料的細胞粘附率:PLGA/HA組為33％;異體骨組為31％
　　 3 細胞增殖的情況 接種后第3、7天,細胞計數見圖1。PLGA/HA與異體骨組比較差異無統計學意義；(p>0.1)
　　 4 ALP活性的定量檢測 見表1接種培養(yǎng)第7,14天,PLGA/HA組與異

6、體骨組比較差異有無顯著意義(p>0.1)
　　 5 鈣結節(jié)的檢測 復合培養(yǎng)兩周后,兩組均可見明顯的鈣結節(jié)形成,并隨時間的延長而增大,四環(huán)素染色后出綠色熒光(圖2)
　　 結論
　　 結果顯示,各材料分別與BMSCs復合培養(yǎng)后,其細胞蛋白及ALP活性均存在,說明細胞在材料上均可以增殖、分泌并表達其功能。本實驗的結果說明,PLGA/HA支架材料其細胞粘附增殖能力不低于異體骨。在本研究中,采用PLGA/HA多孔支架材料