PLGA-HA復(fù)合支架與異體骨體外細(xì)胞相容性的對比實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br>　　 研究新型多孔聚乳酸乙醇酸/羥基磷灰石(PLGA/HA)支架材料的體外細(xì)胞相容性。采用貼壁法對兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)進(jìn)行體外礦化誘導(dǎo)培養(yǎng),擴(kuò)增后與實(shí)驗(yàn)組(含10％HA的PLGA/HA),對照組(異體骨)分別進(jìn)行體外復(fù)合培養(yǎng)；并通過定性及定量法檢測BMSCs在材料表面的粘附能力、增殖活力,驗(yàn)證細(xì)胞材料復(fù)合體的成骨活性。比較分析兩組之間的差異。結(jié)果顯示兔BMSCs在PLGA/HA及異體骨材料的表面均能生長,經(jīng)體外

2、誘導(dǎo)后可形成鈣結(jié)節(jié),PLGA/HA組細(xì)胞的粘附及增殖能力不弱于異體骨組,兩組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 實(shí)驗(yàn)材料與方法
　　 抽取3只新西蘭大耳白兔骨髓間充干細(xì)胞,經(jīng)體外分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增、傳代,并純化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。取經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)的第3代兔BM-SCs,消化后使細(xì)胞濃度為1×106/ml。用移液器吸取細(xì)胞懸液,分別接種在支架材料與異體骨上,直至飽和。將培養(yǎng)板置于50％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4h后,按上述方法再接種一次每塊材料上

3、接種細(xì)胞約1×105,然后加入誘導(dǎo)培養(yǎng)液浸沒材料,置于5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。隔天換液。在倒置相差顯微鏡下,逐日觀察原代和傳代細(xì)胞形態(tài)及粘附增殖情況。于接種后4 h,分別取每種材料各2個(gè)樣本細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算貼壁細(xì)胞數(shù)[細(xì)胞粘附率(％)=貼壁細(xì)胞數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100％]。分別于接種后第3、7天,取出每種材料各2樣本,細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù),各組取平均值,比較各組細(xì)胞增殖情況。分別于聯(lián)合培養(yǎng)后第7天與14天,選擇每種材料各2個(gè)孔,進(jìn)行堿性磷酸酶(a

4、lka linephosphatase,ALP)活性定量檢測。配置10μg/ml的鹽酸四環(huán)素,加入原誘導(dǎo)培養(yǎng)液中,抽濾除菌。于聯(lián)合培養(yǎng)14 d后,棄原培養(yǎng)液,加入上述液體繼續(xù)培養(yǎng),24h后在熒光顯微鏡下觀察鈣結(jié)節(jié)形成情況。
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,對細(xì)胞粘附率及ALP活性的定量進(jìn)行處理,并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 1 細(xì)胞體外培養(yǎng)的觀察BMSCc原代培養(yǎng)約5 d后貼壁生長,逐漸形成克隆,紅細(xì)胞通過換液去除,

5、10～12 d匯合,前兩代生長迅速,細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞型,多為梭形和不規(guī)則三角形,細(xì)胞排列呈漩渦狀、放射狀。
　　 2 細(xì)胞粘附率的測定接種4 h后,每組材料的細(xì)胞粘附率:PLGA/HA組為33％;異體骨組為31％
　　 3 細(xì)胞增殖的情況 接種后第3、7天,細(xì)胞計(jì)數(shù)見圖1。PLGA/HA與異體骨組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；(p>0.1)
　　 4 ALP活性的定量檢測 見表1接種培養(yǎng)第7,14天,PLGA/HA組與異

6、體骨組比較差異有無顯著意義(p>0.1)
　　 5 鈣結(jié)節(jié)的檢測 復(fù)合培養(yǎng)兩周后,兩組均可見明顯的鈣結(jié)節(jié)形成,并隨時(shí)間的延長而增大,四環(huán)素染色后出綠色熒光(圖2)
　　 結(jié)論
　　 結(jié)果顯示,各材料分別與BMSCs復(fù)合培養(yǎng)后,其細(xì)胞蛋白及ALP活性均存在,說明細(xì)胞在材料上均可以增殖、分泌并表達(dá)其功能。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果說明,PLGA/HA支架材料其細(xì)胞粘附增殖能力不低于異體骨。在本研究中,采用PLGA/HA多孔支架材料