人臍帶MSCs與脊髓生物支架相容性的體外研究.pdf

1、目的：使受損脊髓功能得到恢復(fù)依然是再生醫(yī)學(xué)的難題。細(xì)胞移植被普遍認(rèn)為是最有希望治療脊髓損傷的策略之一，但其前景取決于移植物與脊髓斷端融合，并有足夠的軸突再生并跨過脊髓建立有效地連接。為此，利用組織工程支架材料、種子細(xì)胞等工程學(xué)技術(shù)重建脊髓的方法，是近年來研究的熱點(diǎn)<'[1]>。 我們先前的研究業(yè)已表明應(yīng)用化學(xué)萃取的家犬脊髓神經(jīng)基膜樣組織具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化、增殖提供良好載體。最近，我們利用這種質(zhì)地柔軟的脊

2、髓神經(jīng)基膜樣組織作為髓芯，外面包被用天然生物膜材料(國食藥監(jiān)械準(zhǔn)字2006第3460627)做成的帶有腦脊液通道的螺旋凸梁式圓管，制成脊髓生物支架。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菍@種新型脊髓支架與人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cordmesenchymal stem cells，hUCMSCs)的生物相容性進(jìn)行了研究，為橫貫性脊髓損傷動(dòng)物模型及臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 方法：1、脊髓生物支架內(nèi)髓芯的制備：切取幼犬胸段脊髓長約5

3、cm，浸入40ml/L TritonX-100的蒸餾水溶液在4℃冰箱中過夜；蒸餾水浸浴3h后放入40mM/L脫氧膽酸鈉蒸餾水溶液中，置4℃冰箱12h。以上步驟重復(fù)4次。萃取后的髓芯分為三部分：大部分經(jīng)無菌試驗(yàn)處理后置4℃冰箱待用，部分行電鏡及冰凍切片觀察，剩余部分通過真空冷凍干燥處理后保存。 2、人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)：取足月妊娠剖宮產(chǎn)健康胎兒的臍帶，以PBS充分沖洗，剔除臍帶動(dòng)、靜脈，將其余的臍帶間質(zhì)組織切割成直徑約1mm大

4、小的組織塊，在含有20％的胎牛血清、2mM左旋谷氨酰氨(L-Glu)、100U/ml青霉素，10μg/ml鏈霉素的高糖型培養(yǎng)基(HG-DMEM)中培養(yǎng)。原代培養(yǎng)5-7天后，顯微鏡下可見大量細(xì)胞自組織塊中游出，向外呈放射狀貼壁生長。待10天左右，細(xì)胞達(dá)到80％-90％匯合后，加入0.2％胰酶消化傳代。收集第三代MSCs經(jīng)流式細(xì)胞學(xué)檢測細(xì)胞表面抗原證實(shí)其為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞后凍存待用。 3、將用天然生物膜材料做成的帶有腦脊液通道的螺旋

5、凸梁式圓管部分切開，作斷面及內(nèi)表面掃描電鏡觀察，剩余部分圓管套在已制備好的髓芯的上，置4℃冰箱待用。 4、凍存的人臍帶MSCs復(fù)蘇后與脊髓生物神經(jīng)支架相容性研究：對凍存的人臍帶MSCs復(fù)蘇使細(xì)胞密度達(dá)到1×10<'6>/ml，分點(diǎn)注入支架內(nèi)，置入干細(xì)胞一支架體外培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間分別為48、72、96小時(shí)，應(yīng)用冰凍切片及Hitachi掃描、透射電鏡觀察人臍帶MSCs在不同時(shí)間點(diǎn)的生長發(fā)育情況。 結(jié)果：1、經(jīng)組織塊原代

6、培養(yǎng)約5天后，可見大量細(xì)胞自組織塊游出，于周邊向外貼壁呈放射狀生長，形態(tài)較均一，呈長梭形。10天達(dá)到80％-90％匯合，鏡下可見細(xì)胞胞漿豐富，軸突伸長，多角狀。消化后以1:2-1:3的比例傳代細(xì)胞，接種約30分鐘后細(xì)胞迅速貼壁，經(jīng)換液完全匯合時(shí)鏡下可見細(xì)胞排列緊密，無序生長，經(jīng)傳代培養(yǎng)3代后細(xì)胞形態(tài)未見明顯變化，經(jīng)流式細(xì)胞學(xué)檢測MSCs的標(biāo)志抗原CD29、CD44、CD105均為陽性，HLA-D陰性，符合間充質(zhì)干細(xì)胞特性。 2

7、、化學(xué)萃取后的脊髓依然呈長扁圓形，但直徑有所增粗，后正中裂距離加寬，乳白色、質(zhì)軟。HE染色可見經(jīng)化學(xué)方法萃取的脊髓橫切片中無任何細(xì)胞，質(zhì)地較致密，內(nèi)可見蜂窩狀網(wǎng)格。掃描及透射電鏡可見去細(xì)胞髓芯的髓鞘、細(xì)胞等結(jié)構(gòu)均消失，整個(gè)視野由板層樣結(jié)構(gòu)組成，神經(jīng)纖維間基質(zhì)和基底膜形成圓形較規(guī)則、均一的腔隙。特別是掃描電鏡支架中存在神經(jīng)元被化學(xué)萃取后殘留的“空穴”，其大小與神經(jīng)元直徑(1.5-15um)相一致。真空冷凍干燥保存的髓芯肉眼下仍呈長扁圓形，

8、但直徑變小，硬度有所增加，斷面可見組織塊更加致密。 3、天然生物膜材料肉眼下為帶有腦脊液通道的螺旋凸梁式圓管狀。生物膜圓管切開后，掃描電鏡觀察斷面及內(nèi)表面。斷面可見該生物膜圓管呈分層狀，由數(shù)層膜壓制而成，而且部分膜之間夾有數(shù)層較厚的材料。內(nèi)表面在電鏡下觀察可見膠原樣結(jié)構(gòu)呈蜂窩狀。 4、人臍帶MSCs接種于包被生物膜圓管的脊髓生物支架內(nèi)行體外條件養(yǎng)后，取48、72、96小時(shí)三個(gè)時(shí)間段，分別行冰凍切片HE染色、掃描電鏡觀察

9、。冰凍切片HE染色見萃取的脊髓生物支架中有細(xì)胞在蜂窩樣結(jié)構(gòu)內(nèi)生長，細(xì)胞呈點(diǎn)狀、星芒狀散居于間質(zhì)之間，沿間質(zhì)生長，并有突起伸長，經(jīng)過一段時(shí)間部分細(xì)胞呈多角形。掃描電鏡觀察可見細(xì)胞黏附于網(wǎng)格樣結(jié)構(gòu)上，出現(xiàn)明顯的神經(jīng)球，細(xì)胞生長狀態(tài)良好，其表面微絨毛結(jié)構(gòu)清晰可見。神經(jīng)球體積變大，生成多個(gè)突起，形成突觸樣結(jié)構(gòu)。 結(jié)論：凍存的人臍帶MSCs復(fù)蘇后注入自行研制的脊髓生物支架內(nèi)進(jìn)行體外培養(yǎng)，可見注入的人臍帶MSCs在膠原纖維骨架上貼伏并生長良