IGFBP-4保護(hù)下肢缺血性損傷的實驗研究.pdf

1、下肢缺血性疾病是周圍血管疾病(peripheral artery disease，PAD)中最常見的疾病，甚至可以發(fā)展成嚴(yán)重肢體缺血，許多病人最后不得不承受著截肢的痛苦，這些患者的生活質(zhì)量評分甚至比癌癥患者、慢性心臟病患者的評分還低。目前臨床上治療下肢缺血的方法主要是藥物治療和手術(shù)治療等，但是效果仍不滿意。在下肢缺血病理過程中，血管阻塞后致下肢發(fā)生缺血、缺氧性改變，產(chǎn)生大量的氧自由基，從而導(dǎo)致DNA損傷的發(fā)生。而γ-H2AX的形成是DN

2、A雙鏈斷裂的一個標(biāo)志，伴隨DNA損傷的發(fā)生而出現(xiàn)。
　　 研究顯示W(wǎng)nt信號通路在下肢缺血損傷修復(fù)過程中扮演著十分重要的角色，而Wnt信號通路的激活與DNA損傷之間有著十分密切的關(guān)系，這就促使我們?nèi)パ芯縒nt經(jīng)典途徑抑制后是否會導(dǎo)致DNA損傷的減少，從而起到保護(hù)下肢缺血后損傷的作用。最近的研究表明胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-4(Insulin like growth factor bindingproteins-4，IGFBP-4

3、)是強有力的Wnt經(jīng)典通路抑制劑，本研究對IGFBP-4和DNA損傷的關(guān)系及其在下肢缺血損傷修復(fù)過程中的作用進(jìn)行了探討和研究，旨在發(fā)現(xiàn)IGFBP-4對于減少下肢缺血性疾病損傷的重要作用，并為臨床治療提供初步的思路。本研究主要內(nèi)容如下:
　　 目的:探討IGFBP-4在下肢缺血性疾病中的保護(hù)作用，并闡明其具體作用機制，為進(jìn)一步的臨床治療提供理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 1、通過體外實驗，用雙氧水刺激誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生D

4、NA損傷，檢測IGFBP-4對DNA損傷的保護(hù)作用;再通過LiCl(Wnt經(jīng)典途徑的激動劑)刺激和敲除β-catenin(Wnt經(jīng)典信號通路過程中一個重要分子)，驗證IGFBP-4對雙氧水引導(dǎo)的DNA損傷的保護(hù)作用是否通過抑制Wnt經(jīng)典途徑來實現(xiàn)的。
　　 2、在體內(nèi)實驗中，結(jié)扎小鼠下肢股動脈造成下肢缺血模型，將IGFBP-4、PBS(Phosphate Buffer Solution，PBS)局部注射后，使用Laser Dop

5、pler及病理切片觀察IGFBP-4對下肢缺血是否具有保護(hù)作用;再通過Western Blot來驗證該保護(hù)作用是否通過抑制Wnt經(jīng)典途徑減少DNA損傷來實現(xiàn)的。
　　 結(jié)果:在體外實驗中，雙氧水刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human Umbilical VeinEndothelial Cells，HUVEC)能夠引起其發(fā)生γ-H2AX的升高，即導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生了DNA損傷;IGFBP-4能夠?qū)е翲UVEC的β-catenin表達(dá)逐漸下調(diào)，

6、即阻止的Wnt經(jīng)典信號通路，LiCl則引起B(yǎng)-catenin表達(dá)逐漸上調(diào)，即激活了細(xì)胞的Wnt經(jīng)典信號通路;IGFBP-4預(yù)處理HUVEC后能夠減少雙氧水引起的DNA損傷，而LiCl則增加了DNA損傷。
　　 同樣，在小鼠體內(nèi)實驗中，Laser Doppler和病理結(jié)果顯示在下肢缺血模型建立后，注射IGFBP-4組的小鼠下肢損傷程度較對照組要輕;Western Blot的結(jié)果表明IGFBP-4注射的小鼠組織B-catenin表達(dá)

7、水平較注射PBS的小鼠要低，并且γ-H2AX的表達(dá)也低，即DNA損傷程度輕。
　　 結(jié)論:
　　 1、在體外，IGFBP-4能夠保護(hù)H2O2引導(dǎo)的DNA損傷;
　　 2、在體外，IGFBP-4是通過抑制Wnt經(jīng)典信號通路從而減少H2O2刺激引導(dǎo)的DNA損傷;
　　 3、在小鼠體內(nèi)，IGFBP-4能夠保護(hù)下肢缺血性損傷導(dǎo)致的DNA損傷;
　　 4、在小鼠體內(nèi)，IGFBP-4也是通過抑制Wnt經(jīng)典信號