基因在家蠶脂肪體細(xì)胞核抽提物中的體外剪接.pdf

1、在高等真核生物中，前體mRNA的剪接及其調(diào)節(jié)是一個(gè)復(fù)雜的、由多因子參與的過程，它對(duì)基因的正常功能的發(fā)揮起著重要的作用。pre-mRNA剪接，即把內(nèi)含子去除并把外顯子序列連接成為成熟的mRNA，是基因表達(dá)與調(diào)控的重要環(huán)節(jié)之一。選擇性剪接是一個(gè)存在于多細(xì)胞生物中的普遍現(xiàn)象，人類基因中約有30％的基因有選擇性剪接發(fā)生。多細(xì)胞生物的功能、行為和有機(jī)體本身的復(fù)雜性是通過蛋白多樣性的增加或有效地協(xié)調(diào)各組分之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系完成進(jìn)化歷程。 家蠶是

2、重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲，更是經(jīng)典遺傳學(xué)研究的模式生物之一。許多研究證明雄蠶比雌蠶抗性好，體質(zhì)強(qiáng)，葉絲轉(zhuǎn)化率高。單養(yǎng)雄蠶可在不增加成本的前提下提高15％的產(chǎn)絲量，而且雄蠶絲纖度細(xì)、偏差小，絲質(zhì)好，利于繅制高檔生絲。因此，研究家蠶的性別決定機(jī)制，最終實(shí)現(xiàn)單養(yǎng)雄蠶可以有效地提高蠶業(yè)生產(chǎn)效率和經(jīng)濟(jì)效益。同時(shí)鱗翅目昆蟲是主要的農(nóng)林害蟲，而家蠶是鱗翅目昆蟲的典型代表，解明家蠶的性別決定機(jī)制，以家蠶的性別決定機(jī)制為模式，有助于開展農(nóng)林害蟲防治的研究。

3、 在家蠶的性別調(diào)控機(jī)制中，基因的選擇性剪接發(fā)揮了重要作用。因Bmdsx基因在雌蠶和雄蠶中的拼接方式不同而產(chǎn)生性別分化。實(shí)驗(yàn)證明，像果蠅的dsx基因在雌雄中有不同的加工方式一樣，Bmdsx在雌蠶中是默認(rèn)的拼接方式，而在雄蠶中是阻礙性拼接，有一個(gè)上游阻礙物阻礙了第三和第四外顯子的拼接，使雄蠶中缺少了第三和第四外顯子。為了研究Bmdsx上游阻礙物對(duì)Bmdsx拼接的影響，我們建立體外剪接實(shí)驗(yàn)體系來進(jìn)行驗(yàn)證。 為此，我們先利用RAB4B基

4、因建立一個(gè)體外剪接的體系，然后研究miniBmdsx基因在家蠶雄性脂肪體細(xì)胞核抽提物中的體外剪接。RAB4B基因是一個(gè)與細(xì)胞凋亡有關(guān)的基因，大小為1439bp，外顯子為1094bp，內(nèi)含子為345bp。由于Bmdsx基因內(nèi)含子較大，很難在體外發(fā)生拼接反應(yīng)，因此需要構(gòu)建一個(gè)小的Bmdsx基因，我們稱之為miniBmdsx基因。即將大部分內(nèi)含子序列去掉，只剩下含有拼接必需成分的較小內(nèi)含子。構(gòu)建好的miniBmdsx基因大小為2264bp，含

5、有4個(gè)外顯子，3個(gè)內(nèi)含子。將克隆到pGEM-TEasy載體上的miniBmdsx基因經(jīng)PCR擴(kuò)增純化后，體外轉(zhuǎn)錄得到的pre-mRNA，在細(xì)胞核抽提物中進(jìn)行體外剪接。構(gòu)建的miniBmdsx基因在雄蠶核抽提物中發(fā)生剪接時(shí)，第三外顯子和第四外顯子連同內(nèi)含子一同被剪接掉，第二和第五外顯子連在一起，大小為362bp。 在家蠶的性別調(diào)控機(jī)制中，Bmdsx扮演一個(gè)比較重要的角色。Bmdsx通過在雌雄中的選擇性拼接最終決定個(gè)體的雌雄分化，本