豬體細(xì)胞核移植轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究.pdf

1、豬體細(xì)胞核移植轉(zhuǎn)基因技術(shù)在人的動(dòng)物疾病模型和人類(lèi)異種器官移植方面具有巨大優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用潛力，同時(shí)還有望豬育種中應(yīng)用，甚至生產(chǎn)“環(huán)保豬”。它現(xiàn)在已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)。本研究以建立高效的豬體細(xì)胞核移植轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系為目的，并嘗試構(gòu)建轉(zhuǎn)植酸酶基因胚胎，為以后生產(chǎn)“環(huán)保豬”打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　 本試驗(yàn)比較觀察第一極體(The first polar body, pbⅠ), Oosight imaging system觀察和hocchst33

2、342染色法對(duì)第二次減數(shù)分裂中期（MetaphaseⅡ, MⅡ）卵母細(xì)胞判定結(jié)果的相關(guān)性分析，并探討卵巢皮質(zhì)細(xì)胞(porcine ovarian cortex cells, pOCCs)，豬輸卵管上皮細(xì)胞(porcine oviductal epithelial cells, pOECs)和豬卵丘顆粒細(xì)胞(porcine cumulus cells,pCCs)三種單層細(xì)胞體外共培養(yǎng)體系對(duì)豬去卵丘卵母細(xì)胞(cumulus cells de

3、nuded oocytes，Dos)體外成熟(in vitro maturation, IVM)和孤雌發(fā)育的影響。結(jié)果顯示：(1) Oosight imaging system判定卵母細(xì)胞成熟的結(jié)果與hocchst33342染色法判定的結(jié)果有很強(qiáng)相關(guān)性(R=0.973,P＜0.01,N=90)；(2)pOCCs單層細(xì)胞共培養(yǎng)體系中豬去卵丘卵母細(xì)胞成熟率顯著高于pOECs（52.5±0.30％vs43.8±2.18％,P＜0.05），且這

4、兩組成熟率顯著高于其余各組(P＜0.05)；Dos在三種單層細(xì)胞共培養(yǎng)體系培養(yǎng)后，成熟卵母細(xì)胞GSH含量較非共培養(yǎng)組都能顯著升高(P＜0.05),pOCCs組GSH含量最高（7.1±0.32pmol/卵）；(3)成熟后的Dos經(jīng)孤雌激活，pOCCs組和pOECs組卵裂率和囊胚率都顯著高于其余兩組(P＜0.05)。
　　 建立了楓涇豬的35d胎兒成纖維細(xì)胞系、成年耳成纖維細(xì)胞系，輸卵管上皮細(xì)胞系，并分離培養(yǎng)了豬卵泡液中的顆粒細(xì)胞。

5、且比較了脂質(zhì)體介導(dǎo)法中DNA含量、脂質(zhì)體含量和孵育時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響。結(jié)果顯示，四種細(xì)胞系通過(guò)24孔板內(nèi)細(xì)胞匯合85％～90％,1.0μgDNA和2.4μL脂質(zhì)體的用量，孵育4h轉(zhuǎn)染YM6552質(zhì)粒效率最高。且四種細(xì)胞系對(duì)脂質(zhì)體介導(dǎo)法條件要求一致。其中胎兒成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率最高。
　　 在體細(xì)胞核移植轉(zhuǎn)基因過(guò)程中，我們通過(guò)LipofectamineTM2000介導(dǎo)YM6552質(zhì)粒轉(zhuǎn)染四種供核細(xì)胞，并且采用G418對(duì)其進(jìn)行篩選