五味子對(duì)大鼠肝CYP3A酶抑制和誘導(dǎo)雙重作用機(jī)制的探討.pdf

1、五味子為木蘭科多年生落葉木質(zhì)藤本植物北五味子(SchJsandrachinensisbail)的成熟果實(shí),有增加中樞神經(jīng)興奮,增強(qiáng)人體精神、體力和心血管系統(tǒng)張力及心臟收縮力,降低病毒性肝炎患者血清谷丙氨酶等活性。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)五味子水提物和醇提物在短期內(nèi)可抑制CYP3A酶活性,而長(zhǎng)期給藥時(shí)卻又產(chǎn)生誘導(dǎo)作用,但都來(lái)自獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)研究。同一味中藥對(duì)CYP酶活性產(chǎn)生抑制機(jī)制與誘導(dǎo)雙重調(diào)節(jié)的現(xiàn)象并不多見(jiàn)。結(jié)合文獻(xiàn)研究提出一個(gè)假說(shuō),即五味子包括

2、抑制組分和誘導(dǎo)組分:抑制組分直接作用于酶靶點(diǎn),作用時(shí)間短,能迅速改變酶活性;而誘導(dǎo)組分在基因水平起作用,先增加mRNA表達(dá),再提高蛋白表達(dá),需經(jīng)過(guò)一定時(shí)間才能看到酶活性的改變。我們之前的研究,已發(fā)現(xiàn)五味子木脂素中含有顯著抑制CYP3A酶活性的組分。因此本課題旨在離體條件下繼續(xù)考察五味子對(duì)CYP3A酶活性的影響性質(zhì)及程度,驗(yàn)證以上假說(shuō)并確定誘導(dǎo)組分,探討其可能的臨床意義。我們采用大鼠原代肝細(xì)胞模型,通過(guò)測(cè)定CYP3A酶的特異性底物睪酮代謝

3、產(chǎn)物6β羥基睪酮的生成量來(lái)反映CYP3A活性;同時(shí)測(cè)定大鼠原代肝細(xì)胞中CYP3A1mRNA表達(dá)的情況,來(lái)研究五味子水提物、五味子甲素、乙素和醇乙對(duì)肝CYP3A酶的影響。且采用Westernblot法測(cè)定整體給藥時(shí)大鼠肝微粒體CYP3A1酶蛋白的表達(dá)情況,初步研究五味子水提物對(duì)大鼠CYP3A1酶蛋白表達(dá)的影響。
　　第一部分：五味子對(duì)大鼠原代肝細(xì)胞中CYP3A酶活性的影響目的:研究離體條件下五味子水提物、五味子甲素和五味子乙素對(duì)大鼠

4、原代肝細(xì)胞中CYP3A酶活性的影響。方法:提取并培養(yǎng)大鼠原代肝細(xì)胞,處理組加入生藥濃度為O.075、O.75、7.5mg/m1的五味子水提物以及O.01～100PM五味子甲素和0.1～100μM五味子乙素,空白對(duì)照組為溶劑對(duì)照組,陽(yáng)性對(duì)照組加入地塞米松(50μM),共同培養(yǎng)2d后加入CYP3A底物睪酮孵育3h,反應(yīng)終止后用HPLC測(cè)定生成的代謝產(chǎn)物6β-羥基睪酮的濃度,代表CYP3A的酶活性。結(jié)果:(1)離體給藥2天后,五味子水提物各濃

5、度對(duì)大鼠原代肝細(xì)胞CYP3A酶活性都沒(méi)有影響;(2)離體給藥2天后,五味子甲素高濃度(100μM)可使大鼠原代肝細(xì)胞中CYP3A酶活性降低21％(P=0.004),而其余濃度無(wú)影響;(3)離體給藥2天后,隨著五味子乙素的濃度從1μM增加到100μM,大鼠原代肝細(xì)胞中CYP3A酶活性則出現(xiàn)逐漸降低的作用,高濃度(100μM)可使其酶活性降低39％(P=0.001)。結(jié)論:五味子水提物各濃度都對(duì)大鼠原代肝細(xì)胞中CYP3A酶活性無(wú)影響。五味子

6、甲素在高濃度(100μM)時(shí)抑制大鼠原代肝細(xì)胞中CYP3A酶活性,其余濃度均無(wú)作用。此外,五味子乙素(1～100μM)對(duì)大鼠原代肝細(xì)胞中CYP3A酶活性有濃度相關(guān)性抑制作用。
　　第二部分：五味子對(duì)大鼠原代肝細(xì)胞中CYP3A1mRNA表達(dá)的影響目的:研究離體條件下五味子水提物及其單體五味子甲素、五味子乙素和五味子醇乙對(duì)大鼠原代肝細(xì)胞中細(xì)胞色素CYP3A1mRNA表達(dá)的影響。方法:(1)提取并培養(yǎng)大鼠原代肝細(xì)胞,處理組加入生藥濃度為

7、0.625、2.5mg/m1的五味子水提物,空白對(duì)照組為溶劑對(duì)照組,陽(yáng)性對(duì)照組加入地塞米松(50μM),共同培養(yǎng)2d和3d后,用Trizol提取大鼠原代肝細(xì)胞的總RNA,經(jīng)過(guò)RT-PCR測(cè)定生成的CYP3A1DNA含量,來(lái)反映大鼠原代肝細(xì)胞中CYP3A1mRNA的表達(dá)情況。(2)提取并培養(yǎng)大鼠原代肝細(xì)胞,處理組加入0.01、0.1μM血味子甲素和五味子乙素,以及5、10μM的五味子醇乙,對(duì)照組為溶劑對(duì)照組,陽(yáng)性對(duì)照組加入地塞米松(50μ

8、M),共同培養(yǎng)2d后,用Triz01提取大鼠原代肝細(xì)胞的總RNA,經(jīng)過(guò)RT-PCR測(cè)定生成的CYP3A1DNA含量,來(lái)反映大鼠原代肝細(xì)胞中CYP3AlmRNA的表達(dá)情況。結(jié)果:(1)離體給藥2天后,五味子水提物高濃度(2.5mg/m1)可提高大鼠原代肝細(xì)胞中CYP3AlmRNA表達(dá)16％。而給藥3天后,五味子水提物高濃度(2.5mg/m1)可誘導(dǎo)CYP3A1mRNA表達(dá)23％(P=0.022),同時(shí)血味子水提物低濃度(0.625mg/m

9、1)對(duì)CYP3AlmRNA表達(dá)沒(méi)有影響;(2)離體給藥2天后,五味子甲素低濃度(0.0μM)使得大鼠原代肝細(xì)胞中CYP3AlmRNA表達(dá)增加16％,而高濃度(0.1μM)可增加55％(P=0.011);(3)離體給藥2天后,五味子乙素低濃度(0.01μM)使得大鼠原代肝細(xì)胞中CYP3A1mRNA表達(dá)增加21％,而高濃度(0.1μM)可增加49％,有誘導(dǎo)趨勢(shì);(4)離體給藥2天后,五味子醇乙低濃度(5μM)對(duì)大鼠原代肝細(xì)胞中CYP3A1m

10、RNA表達(dá)沒(méi)有影響,而高濃度(10μM)表達(dá)增加27％(P=0.045)。結(jié)論:給五味子水提物高濃度(2.5mg/ml)3d后,可誘導(dǎo)大鼠原代肝細(xì)胞中CYP3A1mRNA的表達(dá),而低濃度(0.625mg/ml)無(wú)影響。五味子甲素(0.1μM)和五味子醇乙(10μM)都可顯著誘導(dǎo)大鼠原代肝細(xì)胞中CYP3A1mRNA的表達(dá),而五味子乙素(0.1μM)具有誘導(dǎo)CyP3AlmRNA表達(dá)的趨勢(shì)。
　　第三部分：五味子水提物對(duì)大鼠肝微粒體CY

11、P3A1酶蛋白表達(dá)的初步研究目的:研究五味子水提物對(duì)大鼠肝微粒體CYP3A1酶蛋白表達(dá)的作用。方法:大鼠灌胃給予五味子水提物(3g/kg),每日一次,于首次給藥后6天,取肝組織制備肝微粒體,用Westernb1ot方法檢測(cè)五味子水提物整體給藥時(shí)CYP3A1酶蛋白表達(dá),研究五味子水提物對(duì)大鼠細(xì)胞色素CYP3A1酶的影響。空白對(duì)照組僅給予蒸餾水,陽(yáng)性對(duì)照組加入苯巴比妥(0.12g/kg)。結(jié)果:整體給藥時(shí),五味子水提物對(duì)大鼠肝微粒體CYP3