蛇床子素對大鼠體內(nèi)CYP3A抑制機(jī)制的研究.pdf

1、背景：前期通過研究蛇床子素（Osthol，Ost）對體外CYP450亞酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)Ost在人肝微粒體中對亞酶CYP3A4、CYP2C9和CYP2D6均有一定抑制作用，但作用較弱；同時研究Ost對大鼠體內(nèi)CYP3A酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)Ost對大鼠體內(nèi)CYP3A有較強(qiáng)的抑制作用。本課題通過大鼠體內(nèi)代謝模型，探索Ost對大鼠體內(nèi)CYP3A抑制的機(jī)制。
　　目的：通過大鼠體內(nèi)給藥實驗研究Ost對大鼠體內(nèi)CYP3A酶的抑制作用，比較單次

2、和多次Ost給藥對大鼠體內(nèi)CYP3A酶活性的影響；使用半定量RT-PCR技術(shù)和Western-blot技術(shù)測定大鼠體內(nèi)給予不同濃度 Ost溶液后大鼠肝臟CYP3A1/2mRNA和蛋白表達(dá)的情況，探明Ost對大鼠肝臟CYP3A1/2mRNA和蛋白表達(dá)的影響。以測定結(jié)果為依據(jù)，綜合分析Ost對大鼠體內(nèi)CYP3A抑制的機(jī)制，為Ost的臨床合理用藥提供理論依據(jù)。
　　方法：⑴選取單一劑量的Ost（20mg/kg），對大鼠單次及多次給藥，設(shè)

3、計溶劑對照組（含吐溫80和0.5％DMSO的生理鹽水液）、實驗組、陽性對照組（給藥酮康唑），使用咪達(dá)唑侖（MDZ）作為探針?biāo)庍M(jìn)行實驗，通過HPLC方法測定大鼠體內(nèi)代謝實驗后血漿中MDZ的濃度，計算MDZ藥代動力學(xué)參數(shù)，分析驗證Ost對大鼠體內(nèi)CYP3A的抑制作用，并比較單次和多次Ost給藥對大鼠體內(nèi)CYP3A抑制作用的區(qū)別。⑵SD大鼠24只，隨機(jī)分成4組，每組6只，分別為低劑量Ost實驗組（10 mg·kg-1）、中劑量組（20 mg·

4、kg-1）和高劑量組（40 mg·kg-1），溶劑對照組，均為腹腔注射給藥，每日一次。連續(xù)給藥7天后，在低溫?zé)o菌條件下取出大鼠肝臟，然后保存于-80℃冰箱。使用Trizol試劑處理大鼠肝組織，并提取總RNA，使用RT-PCR方法電泳檢測生成的CYP3A1/2 DNA含量來研究Ost對大鼠肝臟CYP3A1/2mRNA表達(dá)的影響。⑶用RIPA裂解液提取方法2中經(jīng)給藥處理后的大鼠肝組織樣品，用Westorn-blot方法檢測CYP3A1/2酶

5、蛋白的含量，探討Ost對大鼠肝臟CYP3A1/2酶蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：①建立了檢測大鼠血漿中MDZ的HPLC方法。單次Ost給藥后大鼠血漿中MDZ的藥代動力學(xué)參數(shù)：溶劑對照組AUC(0-t)(356.23 mg·L·min-1)、AUC(0-∞)(377.298mg·L·min-1)、MRT(0-t）（27.555 min）、MRT(0-∞)（30.665min）、T1/2（19.959min）、CLz（0.053L·mi

6、n-1·kg-1）；Ost實驗組AUC(0-t)(503.53 mg·L·min-1)、AUC(0-∞)(518.977 mg·L·min-1)、MRT(0-t）（35.792min）、MRT(0-∞)（40.312min）、T1/2（30.241 min）、CLz（0.01L·min-1·kg-1）；KET陽性對照組AUC(0-t)(1020.462 mg·L·min-1)、AUC(0-∞)(1031.317 mg·L·min-1)、

7、MRT(0-t）（77.173min）、MRT(0-∞)（80.07min）、T1/2（44.691min）、CLz（0.005L·min-1·kg-1）。結(jié)果表明Ost實驗組AUC（0-t）、AUC（0-∞相對于溶劑對照組均有增大(P＜0.05)，T1/2、MRT(0-t）和MRT(0-∞)均有延長(P＜0.05)，CLz也有降低(P＜0.05)。與陽性對照組相比，Ost實驗組MDZ的藥代動力學(xué)參數(shù)變化有較大差異，如陽性對照組AUC（

8、0-∞）相對溶劑對照組增加了173%，但Ost實驗組AUC（0-∞）只增加了37%?？梢钥闯鰡未蜲st給藥對大鼠體內(nèi)MDZ的消除有抑制作用，但作用較弱。多次Ost給藥后大鼠血漿中MDZ的藥代動力學(xué)參數(shù)：Ost實驗組AUC(0-t)(851.785 mg·L·min-1)、AUC(0-∞)(868.542 mg·L·min-1)、MRT(0-t）（82.253min）、MRT(0-∞)（87.711min）、T1/2（53.487 min

9、）、CLz（0.006L·min-1·kg-1）；KET陽性對照組AUC(0-t)(1256.687 mg·L·min-1)、AUC(0-∞)(1482.351 mg·L·min-1)、MRT(0-t）（84.818min）、MRT(0-∞)（141.738min）、T1/2（118.308min）、CLz（0.003L·min-1·kg-1）。多次給予Ost后，Ost實驗組AUC（0-∞）相對溶劑對照組增加了130%，T1/2相對溶劑

10、對照組增加了71%，MRT(0-∞)、MRT(0-t)均明顯延長(P＜0.05)，清除率CLz也明顯降低(P＜0.05)。以上分析可以看出多次Ost給藥對大鼠體內(nèi)MDZ的消除有較強(qiáng)抑制作用。分析比較單次和多次Ost給藥對大鼠體內(nèi)MDZ藥代動力學(xué)參數(shù)的影響，發(fā)現(xiàn)多次Ost給藥組對大鼠體內(nèi)MDZ代謝的抑制作用比單次Ost給藥組的抑制作用強(qiáng)，有顯著性差異。②Ost對大鼠肝臟CYP3A1mRNA表達(dá)的影響與溶劑對照組相比，低劑量組大鼠肝組織中C

11、YP3A1 mRNA的表達(dá)稍有增加，但無顯著性差異；中、高劑量組大鼠肝組織中CYP3A1 mRNA的表達(dá)呈明顯下降趨勢，相比對照組分別降低了24.0%和47.0%。Ost對大鼠肝臟CYP3A2mRNA表達(dá)的影響實驗結(jié)果表明：給藥組肝臟中CYP3A2 mRNA的含量隨Ost劑量的增加沒有明顯的變化趨勢，與溶劑對照組相比，低、中劑量組肝組織中CYP3A2 mRNA的表達(dá)稍有降低，高劑量組肝組織中CYP3A2 mRNA的表達(dá)稍有增加，但均無顯

12、著性差異。③Ost對大鼠肝臟CYP3A1酶蛋白表達(dá)的影響實驗結(jié)果表明：給藥組肝臟中CYP3A1酶蛋白的含量隨Ost劑量的增加依次降低，呈現(xiàn)出濃度依賴性；與溶劑對照組相比，低劑量組大鼠肝組織中CYP3A1酶蛋白的表達(dá)基本不變，無顯著性差異；中、高劑量組大鼠肝組織中CYP3A1酶蛋白的表達(dá)呈明顯下降趨勢，相比對照組分別降低了34.0%和53.0%。Ost對大鼠肝臟CYP3A2酶蛋白表達(dá)的影響實驗結(jié)果表明：給藥組大鼠肝臟中CYP3A2酶蛋白的

13、含量隨Ost劑量的增加依次降低，表現(xiàn)出濃度依賴性；與溶劑對照組相比，低劑量組大鼠肝組織中CYP3A2酶蛋白的表達(dá)稍有降低，但無顯著性差異；中、高劑量組大鼠肝組織中CYP3A2酶蛋白的表達(dá)呈下降趨勢，相比對照組分別降低了29.0%和41.0%。
　　結(jié)論：⑴建立了可靠靈敏的檢查大鼠血漿中MDZ濃度的HPLC方法，通過大鼠體內(nèi)給藥實驗，確證了Ost對大鼠體內(nèi)CYP3A的抑制作用。比較單次和多次Ost給藥，發(fā)現(xiàn)多次Ost給藥對大鼠體內(nèi)C

14、YP3A的抑制作用比單次給藥強(qiáng)。RT-PCR實驗結(jié)果表明，Ost對大鼠肝臟CYP3A2 mRNA的表達(dá)無影響；中、高劑量組對CYP3A1 mRNA表達(dá)有抑制作用。利用Western-blot技術(shù)探索Ost對大鼠肝臟CYP3A1/2酶蛋白表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)中、高劑量Ost實驗組對大鼠肝臟CYP3A1/2酶蛋白表達(dá)均有抑制作用。⑵從大鼠體內(nèi)CYP3A酶活性的變化、CYP3A1/2mRNA表達(dá)水平及CYP3A1/2酶蛋白表達(dá)水平三個層面，綜合闡