miRNA在有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌中的表達(dá).pdf

1、溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文miRNA在有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌中的表達(dá)姓名：吳芳申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：消化內(nèi)科指導(dǎo)教師：黃智銘20090501溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文診斷、判斷預(yù)后、治療的新指標(biāo)。目的：本篇文章研究的目的是通過(guò)m i R N A 在有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌的差異表達(dá)，篩選出與結(jié)腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)m i R N A ，在這些發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上預(yù)測(cè)結(jié)腸癌的進(jìn)展和預(yù)后，最終可以改進(jìn)結(jié)腸癌的預(yù)后判斷和發(fā)現(xiàn)新的治療手段。方法：6 個(gè)新鮮組織取白

2、于溫州醫(yī)學(xué)院附屬一院腫瘤外科。病人先前未作任何處理( 或最近診斷的病人) 。根據(jù)有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，我們把樣本分為2 組( 每組3 個(gè)) ，所選的樣本都已經(jīng)經(jīng)過(guò)細(xì)胞分化和I q ' , l M 分期的評(píng)估，依照臨床分期( 美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)／國(guó)際抗癌聯(lián)盟) 分配如下：3 例為I I 期，3 例為I I I 期。均經(jīng)過(guò)病理專家的鑒定。我們用m i R N A 微陣列( 包含7 2 3 個(gè)探針) 與總的R N A 雜交，使用A g i

3、l e n t G 2 6 5 5 A A 進(jìn)行圖像掃描，F(xiàn) e a t u r eE x t r a c t i o n 軟件讀取數(shù)據(jù)S c a n r e s o l u t i o n5 u m ，P M T 1 0 0 ％，5 ％，最后采用F e a t u r eE x t r a c t i o n 進(jìn)行處理分析。通過(guò)對(duì)芯片質(zhì)控點(diǎn)的計(jì)算，對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，將歸一化后的數(shù)據(jù)按照4 次重復(fù)取中值，然后計(jì)算實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的

4、比值，根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果剔除信號(hào)過(guò)低的點(diǎn)，進(jìn)行差異判斷。在3 組樣本中篩選出大于或2 倍有差異表達(dá)的m i R N A 。然后用熒光定量R T - P C R 對(duì)m i R N A 芯片部分結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。數(shù)據(jù)分析以h s ．u 6 作為內(nèi)參，通過(guò)2 ．A A C T 法計(jì)算有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌與無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌之間目標(biāo)m i R N A表達(dá)水平的差異。其中A C t = C t m i R N A —C t U 6 ，A AC t =

5、 A C t ( 有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌) 一△C t ( 無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌) 。C t 為反應(yīng)的實(shí)時(shí)熒光強(qiáng)度達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)，此時(shí)擴(kuò)增是呈對(duì)數(shù)期增長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，用S t u d e n t ’s tt e s t 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，p < 0 ．0 5 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果：有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌m i R N A 表達(dá)譜差異分析經(jīng)分離m i R N A 專用試劑盒抽提兩種組織的總R N A ，通過(guò)

6、紫外定量和瓊脂糖凝膠電泳分析表明所提取的R N A 無(wú)明顯降解，R N A 的質(zhì)和量基本符合m i R N A 芯片測(cè)定的要求。經(jīng)C y 3 熒光標(biāo)記、純化，進(jìn)行芯片雜交，圖像采集，數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理后，以兩種細(xì)胞C y 3 熒光標(biāo)記信號(hào)強(qiáng)度的比值S O ．5 或丑為標(biāo)準(zhǔn)判定差異表達(dá)m i R N A ，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照的無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌相比，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌中上調(diào)表達(dá)的m i R N A 有4 個(gè)，為m i R - 2 l