布魯氏菌rOmp3148-74-BLS重組載體的構(gòu)建與苜蓿的轉(zhuǎn)化.pdf

1、布魯氏菌病是一種嚴(yán)重的人畜共患傳染病,在世界范圍內(nèi)均有流行。針對(duì)布魯氏菌病,目前廣泛應(yīng)用的是減毒活疫苗,但減毒活疫苗尚存在毒力回復(fù)的危險(xiǎn)?；蚬こ桃呙缈梢钥朔@一問(wèn)題,但傳統(tǒng)的基因工程疫苗往往采用注射的方式接種,不能引發(fā)粘膜免疫。轉(zhuǎn)基因植物疫苗則可克服以上缺點(diǎn),其不僅使用安全,而且通過(guò)飼用或食用的方式接種,還可引發(fā)粘膜免疫。本試驗(yàn)采用紫花苜蓿中苜一號(hào)為受體植物,將布魯氏菌 rOmp3148-74-BLS基因轉(zhuǎn)化苜蓿,從而獲得苜蓿轉(zhuǎn)基因植

2、株。研究?jī)?nèi)容大致如下:
　　首先以LIC引物對(duì)rOmp3148-74-BLS基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,從而使其兩端帶有LIC序列。同時(shí)利用Apa I對(duì)載體pJG045進(jìn)行酶切。利用不依賴于連接反應(yīng)的克隆(LIC)的方法將布魯氏菌rOmp3148-74-BLS基因克隆到植物表達(dá)載體pJG045上,構(gòu)建成重組載體pJG-OB。經(jīng)雙酶切鑒定以及質(zhì)粒DNA測(cè)序鑒定,證明重組載體pJG-OB構(gòu)建成功。測(cè)序結(jié)果與rOmp3148-74-BLS基因序

3、列完全一致。構(gòu)建成功的重組載體為大腸桿菌-農(nóng)桿菌穿梭質(zhì)粒,利用三親本雜交法,將其轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 AGL0。將攜帶有重組質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α作為供體菌,農(nóng)桿菌AGL0作為受體菌。二者在幫助菌大腸桿菌HB101的作用下將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌AGL0。通過(guò)農(nóng)桿菌菌落PCR鑒定,最終篩選出陽(yáng)性農(nóng)桿菌用于苜蓿的侵染。
　　農(nóng)桿菌侵染前首先獲得苜蓿無(wú)菌苗,然后利用無(wú)菌苗制備苜蓿無(wú)菌子葉外植體和下胚軸外植體。再用活化后的農(nóng)桿菌菌液侵染預(yù)培養(yǎng)后的苜蓿

4、外植體。經(jīng)共培養(yǎng)、脫菌處理后,通過(guò)篩選培養(yǎng)獲得苜蓿轉(zhuǎn)基因外植體。再經(jīng)愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)獲得健康的苜蓿愈傷組織。然后經(jīng)分化培養(yǎng)使愈傷組織分化并產(chǎn)生不定芽。再經(jīng)壯苗培養(yǎng),從而獲得苜蓿再生苗。然后將再生苗接種到生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)。生根后的苜蓿再生苗經(jīng)煉苗后將PCR鑒定陽(yáng)性的苜蓿植株移栽至培養(yǎng)土內(nèi)培養(yǎng),最終獲得轉(zhuǎn)基因苜蓿植株。
　　本試驗(yàn)采用LIC法將布魯氏菌rOmp3148-74-BLS基因克隆到植物表達(dá)載體pJG045上,