重組大鼠血小板衍生生長因子(rR-PDGF-AA)對體外培養(yǎng)大鼠椎間盤細胞促增殖的影響作用.pdf

1、背景：自人類行醫(yī)學史記載，頸肩痛、腰腿痛就是其所涉及的內容，而椎間盤退變又是頸腰痛最常見的原因。1934年，Mixter和Barr[1]首先通過手術證實和治愈腰椎間盤突出壓迫神經根所致的坐骨神經痛，從而開創(chuàng)了所謂的“椎間盤時代(Dynasty of the disc)”。髓核摘除這一經典術式70余年來治愈了無數椎間盤病變的患者，然而這70余年來，全世界每年有數千篇相關的文獻發(fā)表，每次相關骨科會議，椎間盤病變仍是最主要的議題之一。這一事實

2、也說明，目前椎間盤退變性疾病的治療仍存在許多問題，需要繼續(xù)深入地研究和探索。近幾年來，組織工程學的研究也擴展到脊柱外科的領域，國外學者開展了組織工程椎間盤相關的基礎研究工作。雖然發(fā)表的研究報告數量尚少，然而卻反應了本研究可喜的前景。 目的：研究與椎間盤變性或再生相關的環(huán)境因素以及椎間盤組織和細胞的生物學行為，觀察血小板衍生生長因子對體外培養(yǎng)椎間盤細胞分裂增殖及基質合成的影響，從細胞水平、分子生物學及基因水平對變性椎間盤進行基因治

3、療和組織工程學研究。 方法： 1、分離并消化大鼠椎間盤組織得到單個細胞并完成原代細胞接種培養(yǎng)。 2、在原代細胞融合傳代后建立對照組與實驗組(施加1μg/L，10μg/L，100μg/L，1000μg/L不同濃度血小板衍生生長因子刺激生長)。 3、采用HE、甲苯胺藍染色法定時于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)、增殖的變化，免疫細胞化學染色法檢測Ⅱ型膠原的表達情況。 4、采用MTT(噻唑藍比色)法測定椎間盤細

4、胞的吸光度值并繪制細胞生長曲線。 5、將傳代細胞消化為單個，經流式細胞儀測定處于S期(DNA合成期)細胞含量。 6、經統(tǒng)計軟件分析得出結論。 結果： 1、在倒置相差顯微鏡下連續(xù)觀察，10天后95％以上的細胞貼壁，原代細胞多為梭形，有偽足伸出；經胰酶消化傳代后，細胞貼壁生長速度加快，而加入血小板衍生生長因子組椎間盤細胞匯合時間縮短，生長加速。 2、HE染色細胞多為梭形，有偽足伸出，細胞核為圓形或橢圓

5、形，圍繞細胞核，胞漿內可見較多空泡；甲苯胺藍染色細胞核為紫色，胞漿染為深藍色。Ⅱ型膠原免疫細胞化學染色呈現陽性結果。 3、MTT法測定椎間盤細胞吸光度(OD)值經過方差分析檢驗可知，F值為20.276，P=0.000，說明五組之間比較差異具有顯著性。五組之間兩兩比較得出，對照組、1μg/L組和10μg/L組之間比較無差異，1000μg/L組和100μg/L組之間比較無差異，對照組、1μg/L組、10μg/L組分別與1000μg/

6、L組、100μg/L組比較差異具有統(tǒng)計學意義，統(tǒng)計學差異顯著(P＜0.05)。 4、隨著生長因子濃度的增加，經流式細胞儀檢測處于S期的細胞數量呈現正相關。rR-PDGF-AA能提高細胞的增殖活性，并且在有效濃度范圍內呈劑量效應關系。 結論：本實驗為椎間盤細胞的培養(yǎng)提供了簡單、有效的方法，血小板衍生生長因子對體外培養(yǎng)的椎間盤細胞的分裂增殖、基質中膠原及蛋白多糖的合成具有促進作用，可明顯提高細胞線粒體活性、增加S期細胞百分比