血小板衍生生長因子在皮膚創(chuàng)面愈合中的調(diào)控機制及藥物作用研究.pdf

1、本課題的研究，有助于進一步闡明PDGF-BB及其受體PDGFR-β在創(chuàng)面愈合中的作用和調(diào)控機制，以及是否通過MMP-9這一靶點促進創(chuàng)面愈合，為PDGF-BB促進創(chuàng)面愈合提出可能的機制。同時，還探討了中藥丹皮酚對這些靶點的調(diào)控作用，為尋找促進創(chuàng)面愈合的藥物提供的了新的思路。 第一部分 PDGF-β受體在人真皮成纖維細胞中的表達及藥物作用研究 1．建立了人真皮成纖維細胞原代培養(yǎng)方法，用MTT法考察了丹皮酚對人真皮成纖維細胞生

2、存性的影響。 2．RT-PCR法證實，在人真皮成纖維細胞中存在PDGFR-β mRNA表達，10μg·L-1TNF-α可顯著上調(diào)PDGFR-β mRNA的表達，丹皮酚能抑制TNF-α引起的PDGFR-β mRNA表達上調(diào)，且存在良好的劑量關系。 3．流式細胞術結果證實，在人真皮成纖維細胞膜表面存在PDGFR-β表達，基礎陽性表達率為28.65±0.06％。10μg·L-1TNF-α刺激成纖維細胞24h能顯著地上調(diào)細胞表面

3、PDGFR-β的陽性表達率，此時的陽性表達率為41.13±5.30％。單獨使用100mg·L-1 Pae刺激成纖維細胞24h后，PDGFR-β在人真皮成纖維細胞上陽性表達率可顯著上調(diào)至37.35±0.31％。當使用10μg．L-1TNF-α與不同濃度(10、50、100 mg·L-1)Pae共刺激時，PDGFR-β陽性表達率分別為41.10±1.29％，39.96±0.91％，33.32±0.95％，結果與僅加10μg·L-1TNF-α

4、相比無統(tǒng)計學差異。上述結果表明，在TNF-α模擬的創(chuàng)面難愈內(nèi)環(huán)境中，PDGFR-β mRNA的表達量和受體在細胞表面的陽性表達率顯著上調(diào)，受體數(shù)目的上調(diào)能夠增強PDGF-BB效應，更大程度的發(fā)揮配體促進成纖維細胞遷移增殖等作用，促進創(chuàng)面的愈合。 第二部分 MMP-9在人真皮成纖維細胞中的表達及藥物作用研究 1．RT-PCR結果表明，MMP-9 mRNA在人真皮成纖維細胞中表達極弱或基本不表達。TNF-α可以誘導MMP-9

5、 mRNA的表達，使其上調(diào)。TNF-α與不同濃度的Pae共孵育，Pae可以顯著抑制TNF-α誘導引起的MMP-9 mRNA表達的上調(diào)，且呈現(xiàn)出良好的量效關系。 2．Western blotting結果顯示，MMP-9在正常人真皮成纖維細胞中表達很弱，10μg·L-1TNF-α可使MMP-9表達顯著上調(diào)。當TNF-α與不同濃度(10、50、100 mg· L-1)的Pae共孵育時，MMP-9的蛋白表達出現(xiàn)顯著下調(diào)，分別下調(diào)8.77

6、％、14.04％和10.53％。 上述結果表明，在TNF-α，模擬的創(chuàng)面難愈內(nèi)環(huán)境中，MMP-9的表達量顯著升高，過高的MMP-9表達量會使得ECM過度降解，延長創(chuàng)面愈合時間。 第三部分 PDGF-BB在人真皮成纖維細胞中對MMP-9表達的影響及藥物作用研究 1．Western blotting結果證實，MMP-9在正常人真皮成纖維細胞中表達較弱，10μg·L-1TNF-α可使MMP-9表達顯著上調(diào)。當使用TNF

7、-α與不同濃度(2、5、10μg·L-1)的PDGF-BB共孵育時，PDGF-BB能夠顯著抑制TNF-α引起的MMP-9表達上調(diào)，其中高劑量(10μg·L-1)PDGF-BB能夠?qū)MP-9表達量極顯著下調(diào)44.68％。100mg·L-1 Pae與10μg·L-1TNF-α時，也能夠顯著抑制TNF-α引起的MMP-9表達上調(diào)，使得MMP-9表達量下調(diào)48.94％。 2．ELISA結果顯示，正常人真皮成纖維細胞MMP-9分泌基礎值

8、較低，為2.328±0.005 pg·mL-1，10μg·L-1TNF-α刺激24h后，真皮成纖維細胞MMP-9分泌量顯著上升至7.371±2.179pg·mL-1。不同濃度(2、5、10μg·L-1)PDGF-BB與TNF-α共孵育均可顯著降低TNF-α引起的MMP-9分泌增加。100 mg·L-1Pae與TNF-α共孵育24h后，MMP-9分泌量也顯著下降至2.325±0.001，接近分泌基礎值。 3．ELISA法檢測人真皮

9、成纖維細胞分泌TIMP-1結果表明，成纖維細胞TIMP-1分泌基礎值為12.952±0.3161pg·mL-1，10μg·L-1TNF-α刺激24h后，TIMP-1分泌量上調(diào)35.01％；不同濃度(2、5、10μg·L-1)PDGF-BB與TNF-α共孵育，TIMP-1出現(xiàn)分泌減少現(xiàn)象，100 mg·L-1Pae與TNF-α共孵育24h后，TIMP-1分泌也出現(xiàn)減少現(xiàn)象，分泌量為12.321±1.093pg·mL-1。 4．分析

10、人真皮成纖維細胞分泌MMP-9/TIMP-1比值得知，正常人真皮成纖維細胞分泌的MMP-9/TIMP-1基礎值為0.180，10μg·L-1TNF-α作用人真皮成纖維細胞24h后，比值上升至0.434。用不同濃度(2、5、10μg·L-1)PDGF．BB與TNF-α共孵育后，MMP-9/TIMP-1比值下降，說明平衡向MMP-9減少的方向移動，10mg·L-1Pae也具有和PDGF-BB相似的效果，能降低TNF-α引起的MMP-9/TI

11、MP-1平衡偏移。 上述結果表明，在TNF-α模擬的創(chuàng)面難愈內(nèi)環(huán)境中，PDGF-BB能夠顯著降低MMP-9的表達和分泌，并促使MMP-9/TIMP-1恢復平衡，這可能是PDGF-BB促進創(chuàng)面愈合的機理之一。100 mg·L-1丹皮酚對于MMP-9蛋白表達和分泌的下調(diào)作用與PDGF-BB相似，提示了其在治療創(chuàng)面難愈方面具有良好的開發(fā)應用潛力。 第四部分 PDGF-BB對真皮成纖維細胞細胞表達細胞因子、趨化因子的影響及藥物作

12、用研究 1．采用ELISA法考察了PDGF-BB及Pae對人真皮成纖維細胞分泌IFN-γ的影響，結果表明，人真皮成纖維細胞IFN-γ分泌基礎值為28.704±4.4E．15 pg·mL-1，單獨使用10μg·L-1PDGF-BB刺激，分泌量下調(diào)12.68％。不同濃度(10、50、100 mg·L-1)的Pae分別與PDGF-BB共孵育后，與對照組相比，50mg·L-1Pae能顯著增加IFN-γ分泌量。 2．采用ELISA

13、法考察了PDGF-BB及Pae對人真皮成纖維細胞分泌IL-6的影響，人真皮成纖維細胞IL-6分泌基礎值為193.965±22.634 pg·mL-1；單獨使用10μg．L-1IPDGF-BB刺激，IL-6分泌值上調(diào)至238.513±11.568 pg·mL-1。不同濃度(10、50、100 mg·L-1)的Pae分別與PDGF-BB共孵育，IL-6分泌值均有顯著下調(diào)。 3．采用ELISA法考察了PDGF-BB及Pae對人真皮成纖

14、維細胞分泌IL-8的影響，人真皮成纖維細胞IL-8分泌基礎值為755.042±34.113 pg·mL-1；單獨使用101μg·L-1PDGF-BB刺激，IL-8分泌值上調(diào)至1025.120±71.775 pg·mL-1上調(diào)35.77％，Pae與PDGF-BB共孵育，與對照組相比，IL-8分泌量均有所下調(diào)，其中，10 mg·L-1Pae下調(diào)極為顯著，50、100 mg·L-1Pae分別將IL-8分泌量下調(diào)20.49％和22.73％。