褪黑素對體外培養(yǎng)大鼠牙乳頭細胞增殖和分化的影響.pdf

1、褪黑素(melatonin,MT)是一種吲哚胺類神經(jīng)內(nèi)分泌激素，在人和哺乳動物主要由松果體分泌，接受中樞神經(jīng)系統(tǒng)下丘腦視交叉神經(jīng)上核(Suprachiasmatic Nuclei，SCN)的調(diào)控。SCN-松果體-MT系統(tǒng)主要調(diào)控機體的生物節(jié)律，以往研究發(fā)現(xiàn)SCN參與調(diào)控牙本質(zhì)的節(jié)律性形成；也有學者提出巨牙癥可能與松果體肥大及褪黑素分泌異常有關(guān)；最新研究發(fā)現(xiàn)成釉器細胞及成牙本質(zhì)細胞表達褪黑素受體MT1。褪黑素是否參與牙齒的發(fā)育值得探討。褪

2、黑素的生物學作用廣泛，除調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律外，還可抗氧化、抗衰老，抗腫瘤，調(diào)節(jié)生長發(fā)育，增強免疫力等。近年來發(fā)現(xiàn)褪黑素具有調(diào)節(jié)骨代謝的作用，能夠促進骨質(zhì)形成、骨折愈合及牙種植體周圍的骨整合；體外可促進成骨細胞的分化，促進骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化。因此，褪黑素可能是除甲狀旁腺素外又一與鈣調(diào)節(jié)有關(guān)的激素。牙本質(zhì)的形成與骨質(zhì)相似，均為細胞外基質(zhì)蛋白分泌及羥基磷灰石沉積的過程，因此我們推測褪黑素在牙本質(zhì)形成過程中也可能起作用。牙乳頭細胞(DPC

3、s)是未分化的外胚間充質(zhì)細胞，是牙髓細胞與成牙本質(zhì)細胞共同的前體細胞，參與牙本質(zhì)的形成及修復(fù)過程，在牙齒發(fā)育及牙髓損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用。本實驗通過體外培養(yǎng)大鼠牙乳頭細胞(ratdental papilla cells，RDPCs)，觀察褪黑素受體MT1、MT2在RDPCs中的表達分布，研究褪黑素對體外培養(yǎng)RDPCs增殖、分化的影響，并進一步觀察MT受體拮抗劑Luzindole對MT作用的影響，初步探討其作用機制。
　　 目的：

4、檢測體外培養(yǎng)RDPCs是否表達褪黑素受體MT1、MT2；研究生理濃度褪黑素對RDPCs增殖、分化的影響，并進一步觀察MT受體拮抗劑對其作用的影響，初步探討其作用機制。
　　 方法：⑴SD大鼠牙乳頭細胞的分離培養(yǎng)：采用組織塊法分離培養(yǎng)新生1天SD大鼠下頜第一磨牙牙乳頭細胞，差別消化法純化細胞。⑵免疫細胞化學技術(shù)檢測褪黑素受體MT1、MT2在RDPCs中的表達分布。⑶MTT比色法檢測生理濃度褪黑素對RDPCs增殖的影響：①檢測普通培

5、養(yǎng)條件下，不同生理濃度褪黑素：10-12mol/L(低濃度組)、10-10mol/L(中濃度組)、10-8mol/L(高濃度組)，在作用24h、48h、72h、96h后各組RDPCs的OD490nm值，并計算各組RDPCs的增殖率。對照組不加褪黑素。②在礦化誘導條件下檢測褪黑素對RDPCs增殖的影響，檢測指標同上。③在以上兩種條件下，中濃度組加入褪黑素受體拮抗劑2μmol/L Luzindole，72h、96h后檢測兩組OD490nm值

6、有無變化。⑷RDPCs分化實驗：①ALP活性檢測試劑盒檢測不同濃度褪黑素作用3天后，各組RDPCs的ALP活性(OD520nm值)。并在高濃度組加褪黑素受體拮抗劑Luzindole(2μmol/L)，觀察OD520nm值有無變化。②免疫細胞化學染色檢測MT(10-8mol/L)對RDPCs DSP表達的影響：實驗分為普通培養(yǎng)組、礦化誘導組、褪黑素組、陰性對照組(PBS替代一抗)。按實驗分組加藥7天后，免疫細胞化學檢測DSP的表達。③Vo

7、nkossa和茜素紅礦化結(jié)節(jié)染色檢測MT(10-8mol/L)對RDPCs體外礦化結(jié)節(jié)形成的影響：實驗分為普通培養(yǎng)組、礦化誘導組、褪黑素組。按實驗分組誘導21天后，分別進行Vonkossa和茜素紅礦化結(jié)節(jié)染色。茜素紅染色后，1％鹽酸酒精處理5min，酶標儀檢測各組OD450nm值。
　　 結(jié)果：⑴組織塊法及差別消化法可得到純化的牙乳頭細胞。⑵RDPCs表達褪黑素受體MT1，不表達MT2。⑶RDPCs增殖實驗：①普通培養(yǎng)條件下加藥

8、24h，各組細胞間的增殖率無明顯差異；48h后，高濃度組低于其它三組(p＜0.05)；72h后，中、高濃度組低于對照組及低濃度組(p＜0.05)；96h后，實驗組均低于對照組(p＜0.05)，且高濃度組低于中、低濃度組。②礦化誘導條件下，在所有時間點，中、高濃度組增殖率均低于對照組及低濃度組(p＜0.05)；72h后，低濃度組增殖率有下降趨勢；96h后，低濃度組明顯低于對照組(p＜0.05)。③在以上兩種培養(yǎng)條件下，中濃度組中加入褪黑素

9、受體拮抗劑后，增殖率無明顯變化(p＞0.05)。⑷RDPCs分化實驗：①ALP活性檢測：高濃度組OD值高于對照組(p＜0.05)，加入拮抗劑Luzindole后，OD值變化不明顯(p＞0.05)。②DSP免疫細胞化學染色顯示：普通培養(yǎng)組染色陰性，礦化誘導組染色弱陽性，褪黑素組染色強陽性。③Vonkossa染色：礦化誘導組與10-8mol/L褪黑素組均可見紅色結(jié)節(jié)染色，普通培養(yǎng)組無明顯結(jié)節(jié)形成；茜素紅染色，兩實驗組OD值均高于對照組(p＜

10、0.05)，但實驗組之間無差異(p＞0.05)。
　　 結(jié)論：①本實驗采用組織塊法體外成功培養(yǎng)了大鼠牙乳頭細胞，并用差別消化法獲得了純化大鼠牙乳頭細胞。②普通培養(yǎng)及礦化誘導條件下生理濃度的褪黑素均可抑制大鼠牙乳頭細胞的增殖，并呈劑量依賴性。③褪黑素可增強大鼠牙乳頭細胞ALP活性，促進大鼠牙乳頭細胞DSP表達，為進一步研究褪黑素促進大鼠牙乳頭細胞分化提供依據(jù)。④大鼠牙乳頭細胞表面表達褪黑素受體MT1，但褪黑素受體拮抗劑不影響其作用