神經(jīng)干細(xì)胞移植聯(lián)合氯化鋰對(duì)急性脊髓損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)的影響.pdf

1、脊髓損傷（Spinal cord injury，SCI）一直是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最棘手的問題之一，其導(dǎo)致?lián)p傷平面以下的機(jī)體部分與大腦的聯(lián)系中斷，損傷平面以下感覺、運(yùn)動(dòng)、括約肌功能永久性障礙，目前仍無有效的治療方法。既往認(rèn)為，中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后其再生、修復(fù)和功能恢復(fù)是絕對(duì)不可能的。1981年神經(jīng)學(xué)家在基礎(chǔ)研究中證實(shí)中樞神經(jīng)損傷后的神經(jīng)結(jié)構(gòu)修復(fù)是可能的，掀起了各國學(xué)者對(duì)脊髓修復(fù)研究的又一次熱潮。SCI后軸突再生障礙的主要原因有：（1）對(duì)脊髓的直接損傷

2、及繼發(fā)炎癥使脊髓內(nèi)功能神經(jīng)元大量壞死或凋亡且神經(jīng)元再生困難；（2）脊髓損傷后暴露的髓鞘相關(guān)抑制分子、軸突生長抑制性蛋白的大量分泌和釋放及繼發(fā)形成的膠質(zhì)瘢痕阻礙了軸突的生長和正確連接；（3）損傷造成局部細(xì)胞凋亡，致使細(xì)胞分泌的神經(jīng)營養(yǎng)因子減少，破壞了神經(jīng)元修復(fù)和支持軸突再生的微環(huán)境。SCI修復(fù)機(jī)制十分復(fù)雜，SCI啟動(dòng)了各種有礙于脊髓再生的基因和調(diào)控基因，因而針對(duì)單一阻礙脊髓再生因素的干預(yù)往往作用有限。目前SCI的修復(fù)研究主要集中在以下幾個(gè)

3、方面：（1）藥物治療：如傳統(tǒng)的大劑量皮質(zhì)類固醇激素（甲基強(qiáng)的松龍）的沖擊治療，可以有效的減輕脊髓的繼發(fā)性炎癥損傷，保護(hù)并防止殘存的損傷神經(jīng)元進(jìn)一步凋亡。目前研究的氯化鋰（LiCl）、免疫抑制劑FK506等除了可以保護(hù)損傷神經(jīng)元外，還可以有效的促進(jìn)損傷軸突再生。（2）細(xì)胞移植：細(xì)胞移植是目前研究的熱點(diǎn)，其原理是利用某些種子細(xì)胞可以分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)、粘附和趨化因子，營養(yǎng)并保護(hù)損傷神經(jīng)元、誘導(dǎo)軸突再生及再髓鞘化來修復(fù)SCI。既往的研究已為SC

4、I修復(fù)提供了較成熟的種子細(xì)胞，如：胚胎干細(xì)胞（ESCs）雪旺氏細(xì)胞（SCs）、嗅鞘細(xì)胞（OECs）、神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）、臍血干細(xì)胞（UCBCs）等，大量研究證實(shí)細(xì)胞移植均能夠在一定程度上促進(jìn)脊髓神經(jīng)功能的恢復(fù)。（3）組織移植：隨著組織工程學(xué)（tissue engineering）的飛速發(fā)展，一種更先進(jìn)的SCI修復(fù)理念逐步形成，即修復(fù)SCI必須包括組織水平上的重建，整合SCI治療研究的各種有效策略，在誘

5、導(dǎo)軸突定向再生的同時(shí)，減少局部膠質(zhì)瘢痕形成。目前，應(yīng)用于脊髓的組織工程支架主要有兩種，一種為人工合成可降解高分子生物材料，如：聚乳酸、聚乙醇酸及其共聚物等，另一種為自體或異體組織移植，如異體胚胎脊髓組織、自體肌纖維支架、游離周圍神經(jīng)（free peripheral nerves，F(xiàn)PN）或帶血管蒂的游離周圍神經(jīng)（vascul-arized peripheral nerve，VPN）組織移植修復(fù)脊髓損傷，也取得了一定的修復(fù)效果。（4）改善

6、脊髓局部微環(huán)境：SCI后軸突再生困難的另一關(guān)鍵因素就是適宜軸突再生的微環(huán)境遭到破壞，各種不利于軸突再生的髓磷脂源性蛋白（myelin，MAG，Nogo-A，Omgp）軸突再生抑制分子大量分泌，而各種神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF、GDNF、NGF、NT3等）的缺乏及膠質(zhì)瘢痕形成阻礙了軸突再生。為此，抑制不利抑制因子分泌提高有利營養(yǎng)因子含量改善局部微環(huán)境成為目前研究重點(diǎn)。（5）聯(lián)合治療：采取聯(lián)合不同作用機(jī)制的治療方法，更好的發(fā)揮協(xié)同作用來促進(jìn)SC

7、I后神經(jīng)修復(fù)。如細(xì)胞移植聯(lián)合藥物共同干預(yù)，或者采用組織工程方法將種子細(xì)胞復(fù)合到人工合成高分子聚合材料或外周神經(jīng)組織制成的支架后移植，或利用基因工程方法將多種神經(jīng)營養(yǎng)因子的基因片段轉(zhuǎn)染到種子細(xì)胞中，制成可分泌特定營養(yǎng)因子的基因工程細(xì)胞來修復(fù)SCI均獲得了令人欣慰的研究成果。 中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）中神經(jīng)元是終末分化細(xì)胞，死亡后不能再生。但近年發(fā)現(xiàn)，成熟CNS中如海馬區(qū)、室管膜下區(qū)、脊髓等區(qū)域仍存在少量具有分裂增殖能力和多分化潛能的

8、NSCs，對(duì)CNS損傷后的修復(fù)有重要意義。CNS受損后NSCs表現(xiàn)出活躍的分裂增殖能力，并分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞等神經(jīng)組織細(xì)胞，但創(chuàng)傷后內(nèi)源性NSCs修復(fù)CNS細(xì)胞缺損是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，最好聯(lián)合外源性NSCs應(yīng)用才能達(dá)到最佳修復(fù)效果。隨著對(duì)于SCI研究的不斷深入，NSCs移植在SCI修復(fù)方面展示了良好的前景，為SCI的修復(fù)帶來了新的希望。 而LiCl在臨床上做為精神穩(wěn)定藥物廣泛應(yīng)用于抗抑郁和躁狂治療，近幾年發(fā)現(xiàn)LiCl無論是在體內(nèi)還

9、是體外對(duì)于神經(jīng)元都有保護(hù)作用。2004年，Jin等發(fā)現(xiàn)治療濃度內(nèi)的LiCl可以促進(jìn)大鼠海馬部位的神經(jīng)前體細(xì)胞表型分化，并且抑制膠質(zhì)細(xì)胞的增生；同年，Yick等應(yīng)用軟骨素酶ABC（ChABC）聯(lián)合氯化鋰治療脊髓損傷，發(fā)現(xiàn)可以明顯促進(jìn)紅核脊髓束神經(jīng)元的再生，這為氯化鋰在以后脊髓損傷治療上的應(yīng)用開創(chuàng)了新的平臺(tái)。 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用改良的Allen法制造大鼠急性脊髓損傷模型，體外培養(yǎng)NSCs并觀察LiCl對(duì)其增殖分化的影響，并將NSCs與LiC

10、l二者結(jié)合起來對(duì)急性脊髓損傷進(jìn)行聯(lián)合干預(yù)，觀察NSCs移植與LiCl聯(lián)合干預(yù)對(duì)于脊髓損傷的修復(fù)效果，并探討其作用機(jī)制，為臨床進(jìn)一步應(yīng)用提供理論依據(jù)。 目的: 1、應(yīng)用改良Allen法進(jìn)行動(dòng)物模型建立，并通過行為學(xué)、組織學(xué)等方法對(duì)該模型進(jìn)行了評(píng)價(jià)，為相應(yīng)急性脊髓損傷的基礎(chǔ)和臨床研究提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。 2、體外培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞并進(jìn)行Nestin免疫組化鑒定，觀察氯化鋰對(duì)于神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化的影響，為聯(lián)合修復(fù)脊髓損傷打下

11、實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 3、觀察NSCs移植與LiCl聯(lián)合干預(yù)對(duì)于脊髓損傷的修復(fù)效果，并探討其作用機(jī)制，為臨床進(jìn)一步應(yīng)用提供理論依據(jù)。 方法: 1、應(yīng)用多中心動(dòng)物脊髓損傷打擊器（MASCIS Impactor）構(gòu)建大鼠胸髓（T10）損傷模型，觀察脊髓損傷后后肢自發(fā)性功能恢復(fù)的規(guī)律和特點(diǎn)，行組織學(xué)檢查觀察損傷組織特點(diǎn)。 2、從新生（生后24小時(shí)內(nèi)）Wistar大鼠的大腦海馬中分離NSCs進(jìn)行體外培養(yǎng)，并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行Nes

12、tin鑒定。 3、應(yīng)用MTT法、BrdU免疫熒光檢測(cè)觀察不同劑量氯化鋰對(duì)于神經(jīng)干細(xì)胞增殖與分化的影響。 4、40只77±5天Wistar大鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組、LiCl組、NSCs組、NSCs+LiCl組，制備T10胸髓打擊傷模型，術(shù)后按照30mg/kg．d劑量持續(xù)腹腔給予LiCl，同時(shí)脊髓損傷局部移植NSCs。通過BBB評(píng)分判斷后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的程度；通過HE染色觀察脊髓白質(zhì)、灰質(zhì)及細(xì)胞間質(zhì)損傷情況；通過神經(jīng)元小體染色（

13、Nissle染色）觀察殘存神經(jīng)元狀態(tài)、分布及再生情況；通過免疫組化染色的方法，觀察損傷局部神經(jīng)元的殘留及神經(jīng)纖維的表達(dá)和分布；并以此來綜合評(píng)價(jià)治療措施對(duì)脊髓損傷的修復(fù)效果。 結(jié)果: 1、應(yīng)用改良Allen法制作大鼠脊髓損傷模型組內(nèi)。BBB評(píng)分差異不大，行組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)損傷處有空洞形成，神經(jīng)纖維斷裂、稀疏，神經(jīng)元小體數(shù)量減少。25mm×10g的打擊方式為推薦方式，既能保證損傷程度，又有利于術(shù)后護(hù)理。 2、應(yīng)用機(jī)械分

14、離乳鼠海馬以及懸浮生長的培養(yǎng)方式可以得到Nestin染色陽性的神經(jīng)干細(xì)胞。 3、20mmol/L氯化鋰組其神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元的比率更高，顯示氯化鋰能促進(jìn)NSCs的增殖與分化。 3、NSCs組與NSCs+LiCl組BBB評(píng)分較LiCl組與對(duì)照組在2周后各時(shí)段差別有意義；NSCs+LiCl組BBB評(píng)分在4周后明顯高于NSCs組；組織學(xué)檢查表明NSCs組與NSCs+LiCl組組織學(xué)改變與LiCl組與對(duì)照組有顯著差別，但是N

15、SCs+LiCl組相對(duì)于NSCs組可以更明顯的促進(jìn)神經(jīng)元再生。 結(jié)論: 1、應(yīng)用改良Allen法制作大鼠脊髓損傷模型具有操作簡捷、損傷程度統(tǒng)一，臨床模擬程度較高的特點(diǎn)。25mm×10g的打擊方式為推薦方式。 2、應(yīng)用機(jī)械分離乳鼠大腦海馬的體外培養(yǎng)方法可以得到純度較高的神經(jīng)干細(xì)胞。 3、氯化鋰可以促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖與分化。 4、在體移植NSCs聯(lián)合LiCl修復(fù)脊髓損傷，可以保護(hù)殘存的神經(jīng)元，促進(jìn)皮質(zhì)