脈沖電磁場(chǎng)促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和成骨分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：(1)體外培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)；(2)研究脈沖電磁場(chǎng)對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響；(3)研究脈沖電磁場(chǎng)對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響；(4)MAPK-ERK、P38信號(hào)通路在脈沖電磁場(chǎng)促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和成骨分化中作用的研究。
　　 方法：用密度梯度離心+貼壁篩選法體外分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells

2、，MSCs)，用于實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞均為第4代細(xì)胞。
　　 (1)體外培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并對(duì)細(xì)胞純度進(jìn)行鑒定。
　　 (2)研究脈沖電磁場(chǎng)對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響，增殖實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行了三次，每次用于增殖實(shí)驗(yàn)的MSCs分為5組，一個(gè)對(duì)照組和四個(gè)磁刺激處理組。將培養(yǎng)板置于Helmholtz線圈中心利用50Hz脈沖電磁場(chǎng)進(jìn)行磁場(chǎng)照射，磁場(chǎng)方向與培養(yǎng)板各孔底平行，每次照射30min，每天兩次，中間間隔11.5h，持續(xù)3d。在

3、完成脈沖電磁場(chǎng)照射處理后，采用四唑鹽比色法(MTT法)測(cè)取細(xì)胞增殖水平。最后在酶標(biāo)儀上以490nm波長(zhǎng)測(cè)取每孔的吸光度值(OD490)。
　　 (3)脈沖電磁場(chǎng)對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響，采用細(xì)胞爬片的方法。對(duì)于磁刺激組，磁場(chǎng)照射時(shí)，采用50Hz脈沖電磁場(chǎng)，磁場(chǎng)方向與培養(yǎng)板各孔底平行，磁場(chǎng)幅值設(shè)為0.8 mT，每次照射30min，每天兩次，中間間隔11.5h，持續(xù)5d。ALP染色檢測(cè)脈沖電磁場(chǎng)對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化

4、的影響。
　　 結(jié)果：(1)體外培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并對(duì)細(xì)胞純度進(jìn)行鑒定，表明本實(shí)驗(yàn)所采用的方法獲得的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的純度較高。
　　 (2)增殖實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以看出：a)變化趨勢(shì)基本相同，說明具有一定的重復(fù)性；b)增殖率與所接受刺激的磁場(chǎng)幅值具有非線性關(guān)系，說明存在窗口效應(yīng)；c)第二次實(shí)驗(yàn)結(jié)果與第一次實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比，磁刺激效果降低。其主要原因是細(xì)胞的增殖具有飽和效應(yīng)，即細(xì)胞在一定面積的培養(yǎng)容器內(nèi)增殖到一定程度后，增

5、殖速度將自動(dòng)減慢；d)通過實(shí)驗(yàn)得出磁感應(yīng)強(qiáng)度有效值在0.8 mT附近，磁效應(yīng)較顯著，經(jīng)過細(xì)化幅值窗口，并通過實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步得出：MSCs細(xì)胞(接種密度為4000個(gè)/孔)在特定刺激模式(50Hz脈沖電磁場(chǎng)，每天刺激2次，每次30min，中間間隔11.5小時(shí)，持續(xù)3d)下，0.8 mT磁刺激組效果最顯著。
　　 (3)50Hz、0.8 mT脈沖電磁場(chǎng)照射(30min/次、2次/d、間隔11.5h、持續(xù)5d)能明顯促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)

6、胞(MSCs)體外成骨分化。
　　 (4)ERK通路在脈沖電磁場(chǎng)促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖中起重要作用，而P38通路的作用相對(duì)較弱；P38通路脈沖電磁場(chǎng)促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促成骨分化過程中起重要作用，而ERK通路則相對(duì)較弱。
　　 結(jié)論：(1)本實(shí)驗(yàn)所采用的方法體外培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的純度較高。(2)脈沖電磁場(chǎng)促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖具有一定的重復(fù)性。(3)脈沖電磁場(chǎng)促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖

7、存在窗口效應(yīng)。(4)脈沖電磁場(chǎng)促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖具有飽和效應(yīng)。(5)MSCs細(xì)胞在50Hz脈沖電磁場(chǎng)，每天刺激2次，每次30min，中間間隔11.5h，持續(xù)3d作用下，0.8 mT磁刺激組效果最顯著。(6)50Hz、0.8 mT脈沖電磁場(chǎng)照射(30min/次、2次/d、間隔11.5h、持續(xù)5d)能明顯促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)體外成骨分化。(7)ERK通路在脈沖電磁場(chǎng)促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖中起重要作用，而P38通路