樹突狀細胞來源外排體對骨髓間充質(zhì)干細胞增殖及成骨分化的影響.pdf

1、間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSC）具有很強的免疫調(diào)節(jié)作用，其主要的靶細胞為樹突狀細胞（dendritic cells，DC）。然而，對于DC對MSC的生物學特性的影響及其介質(zhì)，目前未見系統(tǒng)報告。本實驗以DC釋放的外排體（DC-derived exosome，DCex）為觀察對象，探討了DC對MSC的可能作用。首先，分離培養(yǎng)人骨髓MSC，并從細胞形態(tài)、表型及分化功能予以鑒定。體外誘導培養(yǎng)人骨髓來源的DC，

2、通過觀察細胞形態(tài)、流式檢測表型給予鑒定。應用超速離心法從DC條件培養(yǎng)上清中分離提取DCex，電鏡觀察DCex形態(tài)特點，通過流式檢測明確其細胞來源，BCA蛋白定量法測定DCex蛋白濃度，從而建立一套可靠的制備及鑒定DCex實驗體系。其次，以DAPI標記的MSC為研究對象，將DiI標記的DCex與MSC共培養(yǎng)，應用共聚焦顯微鏡觀察MSC內(nèi)吞DCex的可能性。最后，在無血清MSC培養(yǎng)體系中，分別加入不同蛋白質(zhì)濃度DCex（0、1、2、5、10

3、、15μg·ml-1），以0μg·ml-1組為對照，應用MTT法于24、48、72h后檢測MSC增殖狀態(tài)，并且利用CFSE標記及流式細胞學分析，進一步驗證DCex對MSC的增殖作用。另取第3代MSC，設(shè)為3組培養(yǎng)誘導體系：①對照組：α-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基組；②實驗組：α-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基+DCex（10ug·mL-1）組；③α-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基+標準誘導劑組。采用熒光實時定量PCR、瓊脂糖凝膠電泳檢測各組成骨分化轉(zhuǎn)錄因子Runx2在mRN

4、A水平的表達情況,并進行堿性磷酸酶（ALP）活性檢測。結(jié)果顯示，分離培養(yǎng)的MSC，鏡下為成纖維狀貼壁細胞，可向成骨細胞和成脂細胞分化，表達CD44和CD73，不表達CD31、CD45和HLA-DR，符合國際干細胞協(xié)會關(guān)于間充質(zhì)干細胞的鑒定標準。成功誘導培養(yǎng)出DC，可見DC表面典型的毛刺狀突起，并表達CD80、CD86、CD83、HLA-DR。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，DCex呈圓形或橢圓形膜層結(jié)構(gòu)，直徑為40-100nm，符合外排體的基本形態(tài)特征。

5、流式細胞學分析發(fā)現(xiàn)，DCex表達CD83、CD86、CD80和HLA-DR，證實了DCex的細胞來源。熒光標記的DCex與MSC共培養(yǎng)6h時，可在共聚焦顯微鏡下觀察到MSC胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)熒光，隨著作用時間延長，熒光強度逐漸增強。MTT實驗顯示，以0μg·mL-1DCex組作為對照（增殖率100％），實驗組MSC增殖率分別為：（102.4±7.99）%、（114.6±5.82）%、（135.5±11.9）%、（198.3±17.6）%、（19

6、8.2±32.2）%、DCex濃度為1、2μg·mL-1的增殖效應不明顯（P>0.05）,而濃度為5、10、15μg·mL-1的實驗組與對照組相比，差異顯著（P<0.05）。其中，當DCex濃度為10、15μg·mL-1時對MSCs的促增殖作用更明顯（P<0.001）。與對照組相比， DCex（5、10、15μg·mL-1）組細胞均在48h出現(xiàn)促增殖作用（P<0.001）。CFSE標記及流式檢測也證實DCex可促進間充質(zhì)干細胞增殖。此外

7、，按組培養(yǎng)第7天，DCex實驗組Runx2表達較對照組增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；MSC培養(yǎng)第14天，DCex組ALP含量OD值與對應蛋白比為2.22±0.27，顯著高于陰性對照組（1.20±0.21）（P<0.01），但低于標準誘導組（3.22±0.24）（P<0.05）。
　　上述結(jié)果表明，DCex可被MSC內(nèi)吞由此引起MSC增殖速度加快，并使之向成骨細胞方向分化。因此推測，DCex可能是DC作用于MSC的一種新介