低頻電磁場(chǎng)促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植修復(fù)大鼠脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景和目的：脊髓損傷是由各種原因引起的脊髓結(jié)構(gòu)和功能的損傷，造成損傷平面以下運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)、括約肌及植物神經(jīng)功能等障礙，引起的并發(fā)癥多，致殘率高，目前還沒(méi)有有效的治療方法。這主要是因?yàn)榧顾钃p傷后中樞神經(jīng)系統(tǒng)微環(huán)境惡劣，不利于受損軸突的再生。因此，如何改善脊髓損傷后的不良微環(huán)境、提高脊髓中樞神經(jīng)再生能力，是治療脊髓損傷的關(guān)鍵。很多實(shí)驗(yàn)證實(shí)，低頻電磁場(chǎng)具有促進(jìn)細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)和分化;減輕炎癥水腫、緩解疼痛;促進(jìn)組織再生和減少細(xì)胞凋亡的作用。近來(lái)

2、研究還發(fā)現(xiàn)，低頻電磁場(chǎng)可以明顯改善貓和大鼠脊髓損傷模型的運(yùn)動(dòng)功能，該作用與低頻電磁場(chǎng)加快受損神經(jīng)的再生過(guò)程，并影響生長(zhǎng)因子活性和表達(dá)水平從而有利于軸突運(yùn)輸和神經(jīng)突的再生有關(guān)。隨著干細(xì)胞研究的深入，發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞可在組織修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。其中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)具有多能干細(xì)胞特性，可以分化為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等細(xì)胞。研究已經(jīng)證實(shí)，在體內(nèi)外骨髓來(lái)源的細(xì)胞能形成神經(jīng)細(xì)胞系。而且研究者使用BMSC用于治療脊髓損傷，結(jié)果發(fā)現(xiàn)B

3、MSC移植有助于提高肢體運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。我們課題組前期的研究顯示，低頻電磁場(chǎng)不僅可以促進(jìn)體外培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖而且還具有促進(jìn)其向功能性神經(jīng)元分化的作用。然而，低頻電磁場(chǎng)是否有助于改善脊髓損傷局部微環(huán)境及有助于BMSC移植修復(fù)脊髓損傷大鼠從而促進(jìn)其運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建不完全性脊髓損傷大鼠模型，探討低頻電磁場(chǎng)在移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞大鼠脊髓損傷模型運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)中的作用。
　　 方法：采用全骨

4、髓培養(yǎng)法分離培養(yǎng)大鼠BMSC，觀察原代及傳代細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng)特點(diǎn);采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物和細(xì)胞周期對(duì)培養(yǎng)的BMSC進(jìn)行鑒定。將第3-5代BMSC作為種子細(xì)胞，BrdU進(jìn)行標(biāo)識(shí)后用于移植。采用脊髓壓迫法構(gòu)建64只SD大鼠T10不完全性脊髓損傷模型，并隨機(jī)分成四組即對(duì)照組、BMSC組、EMF組和EMF+BMSC組，每組16只大鼠，造模后按時(shí)間點(diǎn)不同又分為3、7、14和21天四個(gè)亞組，每個(gè)亞組4只大鼠。脊髓損傷后30分鐘內(nèi)，用微量注

5、射器將BrdU標(biāo)記的BMSC懸液注入到BMSC組和EMF+BMSC組大鼠脊髓損傷區(qū)頭、尾側(cè)脊髓實(shí)質(zhì)內(nèi)。脊髓損傷24小時(shí)后，將EMF組和EMF+BMSC組大鼠暴露在低頻電磁場(chǎng)（頻率為50 Hz，強(qiáng)度為5 mT）中，每天60分鐘，每天1次，連續(xù)作用21天;對(duì)照組和BMSC組置于無(wú)低頻電磁場(chǎng)的同樣的環(huán)境中觀察。術(shù)前及術(shù)后第3、7、14和21天，將各組大鼠置于90cm×120cm開(kāi)放空間內(nèi)，雙人、雙盲采用Basso-Beattie-Bresna

6、han(BBB)運(yùn)動(dòng)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能觀察和評(píng)分并對(duì)其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。分別在第3、7、14和21天時(shí)每組處死4只大鼠留取標(biāo)本，HE染色觀察各組損傷脊髓組織病理學(xué)變化情況;免疫組織化學(xué)法分析研究BrdU陽(yáng)性BMSC在脊髓損傷區(qū)的生存情況;免疫熒光法檢測(cè)GFAP、MMP-2和BrdU陽(yáng)性BMSC在脊髓損傷區(qū)的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.利用脊髓壓迫法造模后立即出現(xiàn)一過(guò)性鼠尾痙攣性擺動(dòng)和雙下肢抽動(dòng)，術(shù)后1小時(shí)麻

7、醉清醒后大鼠BBB評(píng)分為0-2分;同時(shí)大腦皮層體感誘發(fā)電位顯示P1、N、P2波的峰潛伏期(Lat)延長(zhǎng)，幅度幾乎為正常的2倍，說(shuō)明成功構(gòu)建了不完全性脊髓損傷模型。
　　 2.分離BMSC后進(jìn)行培養(yǎng)，BMSC形成細(xì)胞團(tuán)簇，有較多突起，細(xì)胞呈現(xiàn)梭形外觀。流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞表面標(biāo)志物鑒定提示培養(yǎng)的BMSC高表達(dá)CD90、CD29、CD44和CD73，而低表達(dá)CD45。第3代BMSC中G0/G1期的細(xì)胞為82.0％，G2期的細(xì)胞為1.46％

8、，S期的細(xì)胞為16.5％，大部分細(xì)胞處于靜止期，只有少數(shù)的細(xì)胞處于活躍的增殖期，符合干細(xì)胞特征。
　　 3.各脊髓損傷模型實(shí)驗(yàn)前BBB評(píng)分結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;實(shí)驗(yàn)后經(jīng)重復(fù)測(cè)量方差分析，結(jié)果顯示組間存在差異(F=36.755，P=0.000)，四種不同處理的大鼠BBB評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;不同時(shí)間點(diǎn)間也存在差異(F=374.025，P=0.000)，各組BBB評(píng)分變化與時(shí)間變化有關(guān)。實(shí)驗(yàn)處理方法與時(shí)間之間有交互作用(F=7.471，

9、P=0.000)，提示處理因素隨時(shí)間的增加，BBB評(píng)分變化趨勢(shì)不同，EMF+BMSC組變化明顯。進(jìn)一步分析單獨(dú)效應(yīng)結(jié)果顯示，第3天時(shí)各組大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能的BBB評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.941，P=0.177)，其余各時(shí)間點(diǎn)內(nèi)各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均=0.000)。7天時(shí)，各組BBB評(píng)分均有提高，四組之間BBB評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=13.918，P=0.000)，但對(duì)照組與EMF組之間和BMSC組與EMF+BMSC組之

10、間的BBB評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，分別為(P=0.240和P=0.472)。14天時(shí)，對(duì)照組與BMSC組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)，對(duì)照組與EMF組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)，對(duì)照組與BMSC+EMF組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000); EMF組和BMSC組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.035)，EMF組和BMSC+EMF組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004);但BMSC組和EMF+BMSC組之間BBB評(píng)分

11、差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.258)。21天時(shí)，對(duì)照組與BMSC組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)，對(duì)照組與EMF組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)，對(duì)照組與BMSC+EMF組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000); EMF組和BMSC組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.009)，EMF組和BMSC+EMF組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000); BMSC組和EMF+BMSC組之間BBB評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.005)。提

12、示BMSC移植和EMF治療均可改善大鼠脊髓損傷模型的運(yùn)動(dòng)功能，兩者相比BMSC組效果較明顯;但低頻電磁場(chǎng)干預(yù)和BMSC移植共同作用于脊髓損傷模型時(shí)，與其他實(shí)驗(yàn)組相比較，EMF+BMSC組大鼠脊髓損傷模型后肢運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)更快更好。
　　 4.術(shù)后第3天各組大鼠損傷脊髓組織結(jié)構(gòu)紊亂，局部有出血、水腫和壞死細(xì)胞形成。第7天，對(duì)照組和EMF組脊髓組織結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，損傷區(qū)有較多壞死液化吸收后形成的囊性空洞，神經(jīng)細(xì)胞明顯減少且變性、腫脹較

13、重，周圍有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，組織進(jìn)一步腫脹，血流減少;BMSC組和EMF+BMSC組損傷區(qū)囊性空洞面積較小、腫脹稍減輕，可見(jiàn)肥大的巨噬細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞等，組織結(jié)構(gòu)仍比較模糊。隨著時(shí)間變化，各組脊髓組織結(jié)構(gòu)逐漸改善，第14天，除了對(duì)照組外，其他三組囊性空洞幾乎閉合，被其它細(xì)胞組織所代替填充，BMSC組組織水腫消失，僅有少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，EMF+BMSC組脊髓損傷結(jié)構(gòu)已大部分修復(fù)，細(xì)胞排列有序，炎細(xì)胞基本消失。術(shù)后第21天，除對(duì)照組外，其他各組損傷

14、脊髓組織結(jié)構(gòu)基本修復(fù)。
　　 5.第14天和21天時(shí)，對(duì)照組脊髓損傷區(qū)可見(jiàn)大量的GFAP陽(yáng)性蛋白;EMF組和BMSC組可見(jiàn)中等量GFAP陽(yáng)性蛋白分布于損傷區(qū)周圍;EMF+BMSC組GFAP陽(yáng)性蛋白最少。BMSC組和EMF+BMSC組的脊髓組織在BMSC移植后第7天，局部組織MMP-2的表達(dá)量開(kāi)始升高，14天最明顯。術(shù)后3～21天，BMSC組和EMF+BMSC組損傷脊髓組織中都可觀察到BrdU陽(yáng)性細(xì)胞，并與組織融合生長(zhǎng)，EMF+B