低頻電磁場促進骨髓間充質干細胞移植修復大鼠脊髓損傷的實驗研究.pdf

1、背景和目的：脊髓損傷是由各種原因引起的脊髓結構和功能的損傷，造成損傷平面以下運動、感覺、括約肌及植物神經功能等障礙，引起的并發(fā)癥多，致殘率高，目前還沒有有效的治療方法。這主要是因為脊髓損傷后中樞神經系統(tǒng)微環(huán)境惡劣，不利于受損軸突的再生。因此，如何改善脊髓損傷后的不良微環(huán)境、提高脊髓中樞神經再生能力，是治療脊髓損傷的關鍵。很多實驗證實，低頻電磁場具有促進細胞的增殖、生長和分化;減輕炎癥水腫、緩解疼痛;促進組織再生和減少細胞凋亡的作用。近來

2、研究還發(fā)現(xiàn)，低頻電磁場可以明顯改善貓和大鼠脊髓損傷模型的運動功能，該作用與低頻電磁場加快受損神經的再生過程，并影響生長因子活性和表達水平從而有利于軸突運輸和神經突的再生有關。隨著干細胞研究的深入，發(fā)現(xiàn)干細胞可在組織修復過程中發(fā)揮重要的作用。其中骨髓間充質干細胞(BMSC)具有多能干細胞特性，可以分化為骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞等細胞。研究已經證實，在體內外骨髓來源的細胞能形成神經細胞系。而且研究者使用BMSC用于治療脊髓損傷，結果發(fā)現(xiàn)B

3、MSC移植有助于提高肢體運動功能的恢復。我們課題組前期的研究顯示，低頻電磁場不僅可以促進體外培養(yǎng)的骨髓間充質干細胞的增殖而且還具有促進其向功能性神經元分化的作用。然而，低頻電磁場是否有助于改善脊髓損傷局部微環(huán)境及有助于BMSC移植修復脊髓損傷大鼠從而促進其運動功能的恢復，國內外尚未見相關報道。因此，本實驗構建不完全性脊髓損傷大鼠模型，探討低頻電磁場在移植骨髓間充質干細胞大鼠脊髓損傷模型運動功能恢復中的作用。
　　 方法：采用全骨

4、髓培養(yǎng)法分離培養(yǎng)大鼠BMSC，觀察原代及傳代細胞的形態(tài)及生長特點;采用流式細胞術檢測細胞表面標志物和細胞周期對培養(yǎng)的BMSC進行鑒定。將第3-5代BMSC作為種子細胞，BrdU進行標識后用于移植。采用脊髓壓迫法構建64只SD大鼠T10不完全性脊髓損傷模型，并隨機分成四組即對照組、BMSC組、EMF組和EMF+BMSC組，每組16只大鼠，造模后按時間點不同又分為3、7、14和21天四個亞組，每個亞組4只大鼠。脊髓損傷后30分鐘內，用微量注

5、射器將BrdU標記的BMSC懸液注入到BMSC組和EMF+BMSC組大鼠脊髓損傷區(qū)頭、尾側脊髓實質內。脊髓損傷24小時后，將EMF組和EMF+BMSC組大鼠暴露在低頻電磁場（頻率為50 Hz，強度為5 mT）中，每天60分鐘，每天1次，連續(xù)作用21天;對照組和BMSC組置于無低頻電磁場的同樣的環(huán)境中觀察。術前及術后第3、7、14和21天，將各組大鼠置于90cm×120cm開放空間內，雙人、雙盲采用Basso-Beattie-Bresna

6、han(BBB)運動評分標準對大鼠后肢運動功能觀察和評分并對其進行統(tǒng)計學分析。分別在第3、7、14和21天時每組處死4只大鼠留取標本，HE染色觀察各組損傷脊髓組織病理學變化情況;免疫組織化學法分析研究BrdU陽性BMSC在脊髓損傷區(qū)的生存情況;免疫熒光法檢測GFAP、MMP-2和BrdU陽性BMSC在脊髓損傷區(qū)的表達情況。
　　 結果：
　　 1.利用脊髓壓迫法造模后立即出現(xiàn)一過性鼠尾痙攣性擺動和雙下肢抽動，術后1小時麻

7、醉清醒后大鼠BBB評分為0-2分;同時大腦皮層體感誘發(fā)電位顯示P1、N、P2波的峰潛伏期(Lat)延長，幅度幾乎為正常的2倍，說明成功構建了不完全性脊髓損傷模型。
　　 2.分離BMSC后進行培養(yǎng)，BMSC形成細胞團簇，有較多突起，細胞呈現(xiàn)梭形外觀。流式細胞術細胞表面標志物鑒定提示培養(yǎng)的BMSC高表達CD90、CD29、CD44和CD73，而低表達CD45。第3代BMSC中G0/G1期的細胞為82.0％，G2期的細胞為1.46％

8、，S期的細胞為16.5％，大部分細胞處于靜止期，只有少數的細胞處于活躍的增殖期，符合干細胞特征。
　　 3.各脊髓損傷模型實驗前BBB評分結果無統(tǒng)計學差異;實驗后經重復測量方差分析，結果顯示組間存在差異(F=36.755，P=0.000)，四種不同處理的大鼠BBB評分差異有統(tǒng)計學意義;不同時間點間也存在差異(F=374.025，P=0.000)，各組BBB評分變化與時間變化有關。實驗處理方法與時間之間有交互作用(F=7.471，

9、P=0.000)，提示處理因素隨時間的增加，BBB評分變化趨勢不同，EMF+BMSC組變化明顯。進一步分析單獨效應結果顯示，第3天時各組大鼠后肢運動功能的BBB評分差異無統(tǒng)計學意義(F=1.941，P=0.177)，其余各時間點內各組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P均=0.000)。7天時，各組BBB評分均有提高，四組之間BBB評分差異有統(tǒng)計學意義(F=13.918，P=0.000)，但對照組與EMF組之間和BMSC組與EMF+BMSC組之

10、間的BBB評分差異無統(tǒng)計學意義，分別為(P=0.240和P=0.472)。14天時，對照組與BMSC組比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)，對照組與EMF組比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.001)，對照組與BMSC+EMF組比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000); EMF組和BMSC組比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.035)，EMF組和BMSC+EMF組比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.004);但BMSC組和EMF+BMSC組之間BBB評分

11、差異無統(tǒng)計學意義(P=0.258)。21天時，對照組與BMSC組比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)，對照組與EMF組比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)，對照組與BMSC+EMF組比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000); EMF組和BMSC組比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.009)，EMF組和BMSC+EMF組比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000); BMSC組和EMF+BMSC組之間BBB評分差異有統(tǒng)計學意義(P=0.005)。提

12、示BMSC移植和EMF治療均可改善大鼠脊髓損傷模型的運動功能，兩者相比BMSC組效果較明顯;但低頻電磁場干預和BMSC移植共同作用于脊髓損傷模型時，與其他實驗組相比較，EMF+BMSC組大鼠脊髓損傷模型后肢運動功能的恢復更快更好。
　　 4.術后第3天各組大鼠損傷脊髓組織結構紊亂，局部有出血、水腫和壞死細胞形成。第7天，對照組和EMF組脊髓組織結構破壞嚴重，損傷區(qū)有較多壞死液化吸收后形成的囊性空洞，神經細胞明顯減少且變性、腫脹較

13、重，周圍有炎性細胞浸潤，組織進一步腫脹，血流減少;BMSC組和EMF+BMSC組損傷區(qū)囊性空洞面積較小、腫脹稍減輕，可見肥大的巨噬細胞和膠質細胞等，組織結構仍比較模糊。隨著時間變化，各組脊髓組織結構逐漸改善，第14天，除了對照組外，其他三組囊性空洞幾乎閉合，被其它細胞組織所代替填充，BMSC組組織水腫消失，僅有少量炎細胞浸潤，EMF+BMSC組脊髓損傷結構已大部分修復，細胞排列有序，炎細胞基本消失。術后第21天，除對照組外，其他各組損傷

14、脊髓組織結構基本修復。
　　 5.第14天和21天時，對照組脊髓損傷區(qū)可見大量的GFAP陽性蛋白;EMF組和BMSC組可見中等量GFAP陽性蛋白分布于損傷區(qū)周圍;EMF+BMSC組GFAP陽性蛋白最少。BMSC組和EMF+BMSC組的脊髓組織在BMSC移植后第7天，局部組織MMP-2的表達量開始升高，14天最明顯。術后3～21天，BMSC組和EMF+BMSC組損傷脊髓組織中都可觀察到BrdU陽性細胞，并與組織融合生長，EMF+B