益腎活血膠囊對(duì)高同型半胱氨酸血癥所致兔動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)炎癥因子表達(dá)調(diào)節(jié)的研究.pdf

1、本研究以高蛋氨酸飲食誘導(dǎo)兔高Hcy血癥并制備AS動(dòng)物模型，以降低血漿Hcy水平的常用藥物葉酸、VitB6、VitB12聯(lián)合治療作為陽(yáng)性對(duì)照，通過(guò)對(duì)高Hcy血癥所致AS兔腹主動(dòng)脈內(nèi)膜、中膜病理改變及超微結(jié)構(gòu)的觀察，以及應(yīng)用熒光實(shí)時(shí)定量PCR和免疫組化技術(shù)檢測(cè)ICAM-1、MCP-1、TGF-β1和MMP-9mRNA及蛋白表達(dá)的改變，并用Western blot和免疫組化檢測(cè)NF-kB抑制因子-a蛋白表達(dá)及NF-κB核移位的變化，探討益腎活

2、血膠囊對(duì)Hcy所致血管壁炎癥的抑制作用，為其臨床防治高Hcy血癥及AS提供科學(xué)依據(jù)。 目的：觀察益腎活血膠囊對(duì)高Hcy血癥所致AS兔血漿Hcy水平、腹主動(dòng)脈壁形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)的改變、血管壁炎癥因子ICAM-1、MCP-1、TGF-β1和MMP-9基因和蛋白表達(dá)的變化、以及對(duì)NF-κB活化的影響，探討益腎活血膠囊對(duì)高Hcy血癥及其所致AS的防治作用及機(jī)理。 方法： 1.試驗(yàn)動(dòng)物：2-3月齡、體重2.0-2.5 kg

3、雄性純種新西蘭兔。 2.建立模型：以充盈球囊損傷腹主動(dòng)脈內(nèi)膜后，2％高蛋氨酸飼料喂養(yǎng)動(dòng)物5個(gè)月，建立高Hcy血癥及AS動(dòng)物模型。 3.動(dòng)物分組：將56只新西蘭兔隨機(jī)分為正常組、模型組、益腎活血膠囊預(yù)防組、益腎活血膠囊小劑量組、益腎活血膠囊中劑量組、益腎活血膠囊大劑量組、西藥對(duì)照組，共7組。 4.觀察指標(biāo)：(1)高效液相色譜技術(shù)檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組兔血漿Hcy濃度；(2)腹主動(dòng)脈壁病理學(xué)觀察；(3)腹主動(dòng)脈壁形態(tài)學(xué)指標(biāo)檢測(cè)

4、：平均內(nèi)膜厚度、中膜厚度、內(nèi)膜面積、內(nèi)膜面積與中膜面積比；(4)透射電鏡觀察腹主動(dòng)脈壁中膜平滑肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)；(5)實(shí)時(shí)定量RT-PCR法檢測(cè)腹主動(dòng)脈ICAM-1、MCP-1、FGF-β1和MMP-9的mRNA表達(dá)；(6)免疫組化法觀察ICAM-1、MCP-1、TGF-β1、MMP-9的蛋白表達(dá)；(7)NF-κB活化情況檢測(cè)：Westernblot檢測(cè)IκB-a蛋白表達(dá)及免疫組化法檢測(cè)NF-κB核表達(dá)情況。 結(jié)果： 1.

5、各實(shí)驗(yàn)組兔血漿Hcy濃度變化與正常對(duì)照組相比，模型組兔血漿Hcy濃度明顯升高；各藥物處理組兔血漿Hcy濃度較模型組均有不同程度下降，其中預(yù)防組下降最為顯著，其次為大劑量組；預(yù)防組和大劑量組與西藥對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；小劑量組和中劑量組與西藥對(duì)照組相比差異無(wú)顯著性。 2.腹主動(dòng)脈壁切片光鏡下HE染色觀察正常對(duì)照組兔腹主動(dòng)脈血管壁內(nèi)膜、中膜、外膜三層結(jié)構(gòu)明顯，內(nèi)膜完整、無(wú)增厚，內(nèi)皮下無(wú)脂質(zhì)沉積，中膜VSMCs細(xì)長(zhǎng)呈梭形，細(xì)

6、胞核藍(lán)染，同心圓狀排列整齊；模型組兔腹主動(dòng)脈壁內(nèi)膜明顯增厚，內(nèi)皮下可見(jiàn)泡沫細(xì)胞聚集，中膜VSMCs排列紊亂，單位面積細(xì)胞核數(shù)量增多；預(yù)防組及各藥物治療組兔腹主動(dòng)脈內(nèi)膜增厚與模型組相比均有所減輕，中膜VSMCs排列欠規(guī)則，單位面積細(xì)胞核數(shù)目略增多。 3.腹主動(dòng)脈形態(tài)學(xué)指標(biāo)比較3.1內(nèi)膜厚度比較：與正常對(duì)照組相比，模型組兔腹主動(dòng)脈IT明顯增加；與模型組相比，各藥物處理組腹主動(dòng)脈IT均有不同程度下降，其中預(yù)防組和大劑量組下降尤為明顯，

7、但是西藥對(duì)照組和小劑量組IT與模型組相比，差異無(wú)顯著性；預(yù)防組和大劑量組IT與西藥對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3.2中膜厚度比較：與正常對(duì)照組相比，模型組及各藥物組兔腹主動(dòng)脈MT雖有不同程度增加，但差異無(wú)顯著性。 3.3內(nèi)膜面積比較：與正常對(duì)照組相比，模型組兔腹主動(dòng)脈IA明顯增加；與模型組相比，各藥物處理組IA均有所下降，其中預(yù)防組和大劑量組下降尤為明顯，然而西藥對(duì)照組IA與模型組相比，差異無(wú)顯著性；預(yù)防組IA與西

8、藥對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3.4內(nèi)膜與中膜面積比(IA/MA)：與正常對(duì)照組相比，模型組兔腹主動(dòng)脈IA/MA顯著增加(P＜0.01)；與模型組相比，各藥物處理組兔腹主動(dòng)脈IA/MA均明顯下降(P均＜0.05)；預(yù)防組、大劑量組與西藥對(duì)照組相比差異具有顯著性(P均＜0.05)。 4.腹主動(dòng)脈壁中膜平滑肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變正常組兔血管中膜平滑肌細(xì)胞呈紡錘形，密斑密體排列規(guī)則，肌絲含量豐富，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無(wú)腫脹，呈典型

9、的收縮型細(xì)胞特征；模型組可見(jiàn)血管平滑肌細(xì)胞向內(nèi)膜遷移，核固縮，肌絲減少，線粒體明顯腫脹，呈空泡狀，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體和高爾基體等細(xì)胞器增多，呈明顯的合成型細(xì)胞特征；益腎活血膠囊不同處理組，中膜平滑肌細(xì)胞形態(tài)均有不同程度的改善，與模型組相比，線粒體腫脹減輕，密斑密體可見(jiàn)，肌絲含量增加，恢復(fù)收縮型細(xì)胞特征；西藥對(duì)照組平滑肌細(xì)胞形態(tài)改善不明顯。 5.腹主動(dòng)脈壁ICAM-1、MCP-1、TGF-β1、MMP-9mRNA表達(dá)水平比較(1)

10、 ICAM-1mRNA表達(dá)比較：與正常對(duì)照組相比，模型組兔血管壁ICAM-1mRNA表達(dá)顯著升高(P＜0.01)；各藥物處理組ICAM-1 mRNA表達(dá)較模型組均有不同程度下降，其中預(yù)防組下降最為顯著(P＜0.01)，其次為大劑量組(P＜0.01)，小劑量組ICAM-1mRNA表達(dá)與模型組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；預(yù)防組和大劑量組與西藥對(duì)照組相比差異具有顯著性(P均＜0.05)。 (2) MCP-1mRNA表達(dá)比較

11、：與正常對(duì)照組相比，模型組兔血管壁MCP-1mRNA表達(dá)顯著升高(P＜0.01)；與模型組相比，各藥物處理組MCP-1mRNA表達(dá)均顯著下降(P均＜0.05)；預(yù)防組、中劑量組和大劑量組與西藥對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)。 (3) TGF-β1mRNA表達(dá)比較：與正常對(duì)照組相比，模型組兔血管壁TGF-β1mRNA表達(dá)顯著升高(P＜0.01)；與模型組相比，各藥物處理組TGF-β1mRNA表達(dá)均明顯下降(P均＜0

12、.05)；預(yù)防組與西藥對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 (4) MMP-9mRNA表達(dá)比較：與正常對(duì)照組相比，模型組兔血管壁MMP-9mRNA表達(dá)明顯升高(P＜0.01)；與模型組相比，各藥物處理組MMP-9mRNA表達(dá)均顯著下降(P均＜0.01)；預(yù)防組和大劑量組與西藥對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)。 6.腹主動(dòng)脈壁ICAM-1、MCP-1、TGF-β1、MMP-9蛋白表達(dá)水平比較(1)

13、 ICAM-1蛋白表達(dá)比較：與正常對(duì)照組相比，模型組兔血管壁ICAM-1蛋白表達(dá)顯著升高(P＜0.01)；小劑量組和西藥對(duì)照組兔ICAM-1蛋白表達(dá)與模型組相比，差異無(wú)顯著性(P＞0.05)，預(yù)防組、中劑量組和大劑量組則較模型組明顯下降(P均＜0.05)；預(yù)防組和大劑量組兔ICAM-1蛋白表達(dá)明顯低于西藥對(duì)照組，也顯著低于小劑量組(P均＜0.01)。 (2) MCP-1蛋白表達(dá)比較：與正常對(duì)照組相比，模型組兔血管壁MCP-1蛋白

14、表達(dá)顯著升高(P＜0.01)；與模型組相比，各藥物處理組MCP-1蛋白表達(dá)均明顯下降(P均＜0.01)；預(yù)防組和大劑量組與西藥對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。 (3)TGF-β1蛋白表達(dá)比較：與正常對(duì)照組相比，模型組兔血管壁TGF-β1蛋白表達(dá)顯著升高(P＜0.01)；小劑量組、中劑量組和西藥對(duì)照組兔TGF-β1蛋白表達(dá)與模型組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＞0.05)，預(yù)防組和大劑量組TGF-β1蛋白表達(dá)較模型組明顯下降(

15、P均＜0.01)，且分別顯著低于西藥對(duì)照組、小劑量組和中劑量組(P均＜0.05)。 (4)MMP-9蛋白表達(dá)比較：與正常對(duì)照組相比，模型組兔血管壁MMP-9蛋白表達(dá)顯著升高(P＜0.01)；與模型組相比，各藥物處理組MMP-9蛋白表達(dá)均有所下降(P均＜0.05)，其中以大劑量組下降最為顯著(P＜0.01)，其次為預(yù)防組(P＜0.01)；大劑量組和西藥對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。 7.腹主動(dòng)脈NF-kB活

16、化情況比較Western blot分析顯示，模型組兔血管壁IkB-a蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組明顯減少(P＜0.01)，提示高Hcy血癥促進(jìn)IκB-a蛋白的降解；與模型組相比，各藥物處理組IκB-a蛋白表達(dá)均有不同程度的升高，其中以大劑量組回升最為顯著(P＜0.01)，小劑量組IκB-a蛋白表達(dá)與模型組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；大劑量組IκB-a蛋白表達(dá)與西藥對(duì)照組比較，差異有顯著性(P＜0.01)。 免疫組化顯示，模型

17、組兔血管壁NF-κBp65核表達(dá)比例較正常對(duì)照組明顯增多(P＜0.01)，提示高Hcy血癥促進(jìn)NF-κB的核移位；與模型組相比，各藥物處理組NF-κB p65核表達(dá)比例均有不同程度的下降，其中以預(yù)防組下降最為顯著(P＜0.01.)，其次為大劑量組(P＜0.01)；預(yù)防組NF-κB p65核表達(dá)比例與西藥對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 結(jié)論： 1.益腎活血膠囊能夠降低實(shí)驗(yàn)兔血漿Hcy水平。 2.益腎