唾液miRNA對(duì)食管癌預(yù)測(cè)診斷價(jià)值的探討.pdf

1、背景和目的
　　 就全球范圍而言，食管癌在各癌癥發(fā)病率中排第八位，死亡率排第六位。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2008年，全球新發(fā)482，300例，死亡406，800例。發(fā)病率在全球各地相差16倍左右。非洲東部和北部以及東亞地區(qū)是全球高發(fā)區(qū)，而西非、中非和中美洲則是低發(fā)區(qū)。男女發(fā)病比例在3∶1到4∶1之間。在過(guò)去半個(gè)世紀(jì)，食管癌發(fā)病率在西方國(guó)家持續(xù)增加。中國(guó)是食管癌的高發(fā)國(guó)，高發(fā)區(qū)發(fā)病率可高達(dá)100/100000以上。在中國(guó)，由食管癌導(dǎo)致死亡人數(shù)占

2、了全球總死亡人數(shù)的70％以上。
　　 食管癌患者的5年總體生存率只有3％-10％。但對(duì)于癌癥分期在Ⅰ期的患者，如果接受手術(shù)治療后，5年生存率可提升至90％以上。因此食管癌的早診早治極為重要。目前，食管癌的臨床診斷主要依賴于內(nèi)鏡下的組織活檢，但由于這種方法多是在病人出現(xiàn)明顯的癥狀時(shí)檢查，且操作具有創(chuàng)傷性，費(fèi)用較高，及引起病人的不適等，結(jié)果待到明確診斷時(shí)，病人多已是腫瘤晚期。因此臨床很有必要挖掘食管癌早期診斷標(biāo)志物。
　　

3、眾多研究已表明miRNAs表達(dá)失調(diào)與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，miRNAs可作為腫瘤標(biāo)志物對(duì)腫瘤具有診斷有價(jià)值。多種miRNAs已被發(fā)現(xiàn)在食管癌患者的組織和血漿內(nèi)表達(dá)失調(diào)，但在唾液中表達(dá)水平及對(duì)食管癌的預(yù)測(cè)診斷價(jià)值如何，至今國(guó)內(nèi)外未見研究報(bào)道。由于唾液血運(yùn)豐富，唾液被認(rèn)為是血循環(huán)的末端產(chǎn)物，很多血液中的分子物質(zhì)也見于唾液中。所以唾液被喻為“人體健康的一面鏡子(a mirror of the body's health)”，能反映機(jī)體的各種

4、疾病狀態(tài)，如癌癥、感染性疾病和心血管疾病等。近年來(lái)也有研究報(bào)道組織、血漿和唾液三者具有相似的miRNA表達(dá)譜。同時(shí)，食管癌患者主要癥狀為吞咽困難和飲食后反流甚至嘔吐，因此，患者口腔中可能殘留由食管反流入口腔的癌細(xì)胞，增加了唾液miRNAs的含量和對(duì)食管癌檢測(cè)的特異性。本研究分為篩查階段和驗(yàn)證階段。在篩查階段中首先通過(guò)生物芯片技術(shù)篩選出在食管癌患者唾液中差異表達(dá)的靶miRNAs，然后在驗(yàn)證階段中通過(guò)RT-PCR技術(shù)驗(yàn)證靶miRNAs的表達(dá)

5、水平，探索其在食管癌中預(yù)測(cè)診斷價(jià)值。
　　 方法
　　 一、樣本量估計(jì)
　　 在篩查階段中，測(cè)得miR-144對(duì)食管癌的敏感性為85.7％數(shù)據(jù)見“數(shù)據(jù)----預(yù)實(shí)驗(yàn)”文件夾。根據(jù)樣本量估計(jì)的公式n=u(α/22)P(1-P)/δ2
　　 公式中病例組n為所需例數(shù)，uα/2為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，α所對(duì)應(yīng)的雙側(cè)正態(tài)分布界值，P為敏感性的預(yù)期值，δ為允許誤差。
　　 根據(jù)本研究組獲得標(biāo)本的能力，檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α=0.

6、05（uα/2=1.96），δ取0.11。代入上述公式，得病例組所需例數(shù)n=1.962×0.857×(1-0.857)/0.152≈38.9=39。即本研究在驗(yàn)證階段中，病例組需最少取39例。本研究最終取39例。按照本研究組獲得標(biāo)本的能力，設(shè)定病例組例數(shù)∶對(duì)照組例數(shù)=39∶19，本研究最終取19例。
　　 二、對(duì)象選擇
　　 隨機(jī)收集2011年7月至2012年2月廣東省人民醫(yī)院收治的46例食管癌患者唾液上清標(biāo)本。所有食管

7、癌患者均經(jīng)消化內(nèi)鏡活檢病理證實(shí)，并且無(wú)伴發(fā)其他系統(tǒng)器質(zhì)性疾病，如肝炎、糖尿病等。癌癥分期按Union for International CancerControl(UICC)第七版指南標(biāo)準(zhǔn)劃分。癌癥分期為Ⅰ至Ⅲ期者由手術(shù)病理確定癌癥分期。癌癥分期為Ⅳ期者通過(guò)遠(yuǎn)處淋巴結(jié)穿刺活檢或PET-CT檢查確定分期。無(wú)法確定分期的患者是因患者拒絕接受治療或進(jìn)一步檢查。以22例年齡、性別、種族匹配、無(wú)任何腫瘤病史的健康體檢者作為正常對(duì)照組。所有研究個(gè)

8、體均簽署知情同意書。
　　 三、唾液收集
　　 在唾液收集前，研究個(gè)體需禁食、禁飲、禁煙和禁止口腔清潔2h以上。為增加唾液收集量，采用2％檸檬酸溶液濕潤(rùn)無(wú)菌棉簽棉花頭，然后將棉花頭放于研究個(gè)體舌頭一側(cè)的后側(cè)壁約5s，吐出唾液后，再將棉簽放到另一側(cè)的舌頭后側(cè)壁。如此反復(fù)收集。唾液收集量需達(dá)5ml以上，收集管使用50ml無(wú)菌無(wú)酶離心管。其中取2ml作全唾液標(biāo)本，余下3ml唾液作唾液上清標(biāo)本。同一研究個(gè)體都留有一份全唾液樣本和

9、一份唾液上清樣本。唾液上清收集條件:4℃、3000g離心15min取上層上清至1.5ml Eppendoff管，再以4℃、12000 g離心10 min后再棄沉淀取上清。標(biāo)本收集好后需2h之內(nèi)作出處理。標(biāo)本處理后均置-80℃保存。
　　 四、篩查階段的芯片檢測(cè)
　　 在食管癌組中隨機(jī)選入7例全唾液標(biāo)本和健康對(duì)照組中隨機(jī)選入3例全唾液樣本。兩組個(gè)體在性別、年齡和種族上嚴(yán)格匹配。所入選的食管癌患者中，病理類型均為鱗癌，其中包

10、括1例Ⅰ期、1例Ⅱ期、3例Ⅲ期，2例Ⅳ期。利用Agilent microarray技術(shù)，檢測(cè)樣品中923種miRNAs的表達(dá)水平。篩選出6個(gè)miRNAs是作為靶miRNAs進(jìn)行后續(xù)的驗(yàn)證試驗(yàn)。篩選方法如下:因?yàn)間TotalGeneSignal相對(duì)于每個(gè)miRNA的表達(dá)值，因此對(duì)于同一種miRNA，利用此值作條形圖。從條形圖高低趨勢(shì)判斷最具表達(dá)差異的miRNAs作為靶miRNAs。由此篩選出5個(gè)靶miRNAs: miR-144、miR-1

11、0b*、miR-451、miR-486-5p、miR-634。此外，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，miR-21在食管癌患者的病變組織和血漿中都顯著高表達(dá)，因此雖然miR-21在芯片檢測(cè)中沒有顯示出表達(dá)差異的趨勢(shì)，但也入選進(jìn)行分析。
　　 五、驗(yàn)證階段
　　 對(duì)來(lái)自39例食管癌患者和19例正常對(duì)照的58份全唾液和58份唾液上清樣本采用mirVana PARIS Kit（Ambion公司）試劑盒抽提唾液中的總RNA。取1ml唾液上清或全唾液

12、，按照試劑盒的操作說(shuō)明抽提總RNA，使用30μL無(wú)核酸酶水溶解RNA放-80℃保存。取2μLRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。取反轉(zhuǎn)產(chǎn)物3μL作為模板，用SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒(TaKaRa公司)進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)，以miR-16為內(nèi)參。所有反應(yīng)采用3復(fù)孔。采用Biorad CFX962.1實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行檢測(cè)。所測(cè)得的Ct值需同時(shí)滿足以下三個(gè)條件，否則該反應(yīng)需重做直至滿足仨?xiàng)l件為止:①3復(fù)孔Ct值之間的標(biāo)準(zhǔn)差需小于0.5

13、;②每個(gè)反應(yīng)的溶解曲線波峰需單一;③每個(gè)Ct值需＜36。miRNAs的表達(dá)量采用2-△△Ct表示[19]。即:標(biāo)本i△Ct=標(biāo)本iCtmiR-21-標(biāo)本iCtmiR-16（內(nèi)參）;標(biāo)本i△△Ct=標(biāo)本i△Ct-對(duì)照組△Ct的平均值。
　　 六、數(shù)據(jù)處理
　　 采用SPSS13.0或MedCalc12.2.1統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。miRNA表達(dá)量和年齡兩組組間差異使用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，三組間或以上比較使用Kru

14、skal-Wallis H檢驗(yàn)。性別組間差異使用卡方檢驗(yàn)。對(duì)吸煙、酗酒、喝熱飲、吃熱食習(xí)慣和潮汕籍4項(xiàng)危險(xiǎn)因素?cái)M合Logistic回歸模型，采用偏最大似然估計(jì)前進(jìn)法(Forward LR)算出4項(xiàng)危險(xiǎn)因素的相對(duì)危險(xiǎn)度(Odds Ratio，OR)。各OR值顯著性檢驗(yàn)采用卡方檢驗(yàn)。應(yīng)用ROC(Receiver Operating Characteristic)曲線評(píng)價(jià)診斷效能。使用Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)分析同一種miRNA在全唾液和唾

15、液上清中表達(dá)水平的相關(guān)性。各靶miRNAs診斷效能的差異性比較使用MedCalc12.2.1統(tǒng)計(jì)軟件中的Delong法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果
　　 一、唾液miRNA表達(dá)譜
　　 利用Agilent microarray技術(shù)，檢測(cè)7份來(lái)自食管癌患者和3份健康人共10份全唾液樣品中923種miRNAs的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有461種miRNAs在唾液中存在表達(dá)。其中食管癌標(biāo)本發(fā)現(xiàn)452種，對(duì)照

16、樣本發(fā)現(xiàn)391種。有232種miRNAs在10份樣本中都存在表達(dá)。其中有261種miRNAs在食管癌標(biāo)本中存在表達(dá)，243種miRNAs在對(duì)照樣本中存在表達(dá)。在所檢查的miRNAs中，有25種miRNAs在食管癌組和健康對(duì)照組中存在差異性表達(dá)
　　 二、全唾液和唾液上清miRNA對(duì)食管癌的診斷價(jià)值
　　 根據(jù)microarray檢測(cè)結(jié)果，挑選出miR-10b*、miR-144、miR-21、miR-451、miR-486

17、-5p、miR-634為靶miRNAs分子。進(jìn)一步采用RT-qPCR技術(shù)驗(yàn)證該6種發(fā)miRNAs的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)現(xiàn)全唾液中的miR-10b*、miR-144、miR-451和唾液上清的miR-10b-3p、miR-144、miR-21、miR-451在患者組較對(duì)照組的表達(dá)水平明顯上調(diào)。這7個(gè)指標(biāo)在診斷食管癌的敏感性分別為:89.7％、92.3％、84.6％、79.5％、43.6％、87.2％、51.3％。特異性分別為:57.9％、47.

18、4％、57.9％、57.9％、89.5％、47.4％、84.2％。
　　 三、不同ROC曲線下面積(AUC)的對(duì)比
　　 我們使用MedCalc12.2.1統(tǒng)計(jì)軟件中的Delong法對(duì)各AUC進(jìn)行差異性比較，全唾液miR10b*、·miR-144、miR-451的AUC(P值分別為0.762、0.706、0.756)和唾液上清miR10b*、miR-144、miR-451的AUC（P值分別為0.702、0.682、0.7

19、25）差異性沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;即同一種miRNA在全唾液和唾液上清中分別對(duì)食管癌的診斷價(jià)值差異性不顯著。然后，對(duì)全唾液中對(duì)食管癌有診斷價(jià)值的3個(gè)miRNAmiR10b*、miR-144、miR-451的AUC進(jìn)行兩兩間比較。結(jié)果顯示差異也均不顯著。p值分別為0.2356(miR10b* VS miR-144)、0.8959（miR10b*VSmiR-451）、0.3248(miR-144 VSmiR-451)。最后，再對(duì)唾液上清中對(duì)食管癌

20、有診斷價(jià)值的4個(gè)miRNA miR10b*、miR-144、miR-21、miR-451的AUC進(jìn)行兩兩間比較。結(jié)果顯示差異均不顯著。p值分別為0.8251（miR10b* VSmiR-21）、0.7699(miR10b*VSmiR-451)、0.7102(miR10b* VS miR-144)、0.6079(miR-21VSmiR-451)、0.8729(miR-21 VS miR-144)、0.3529(miR-144 VSmiR-

21、451)。
　　 四、全唾液與唾液上清miRNA表達(dá)水平的相關(guān)性
　　 每個(gè)研究個(gè)體均留有全唾液和唾液上清樣本。上述結(jié)果顯示miR10b*、miR-144、miR-451在患者的全唾液和唾液上清中的表達(dá)水平均顯著上調(diào)。利用Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)分析此3種miRNA在全唾液和唾液上清中表達(dá)水平的相關(guān)性。結(jié)果顯示，3種miRNAs在全唾液和唾液上清中的表達(dá)水平均具有良好的正相關(guān)關(guān)系。p值分別為0.000（miR10b*）