利用秀麗線蟲研究Ngb的抗氧化損傷作用及細胞骨架蛋白的缺氧應答機制.pdf

1、秀麗線蟲(Caenorhabditis elegans,C. elegans)是1974年Brenner首次公開報道的模式生物,其優(yōu)點很多,是進行遺傳、基因研究方面的首選模式生物。線蟲生長周期短,實驗室飼養(yǎng)簡便,具備完整的發(fā)育和解剖學特征,已完成全基因組測序,基因操作便捷,如轉基因、基因突變、RNA干涉等。本研究將線蟲應用于Ngb對氧化損傷的作用研究及缺氧狀態(tài)下細胞骨架的變化分析,旨在促進對低氧應答機制的理解及氧化應激損傷保護的防護基礎

2、研究。
　　1、利用秀麗線蟲研究Ngb抗氧化損傷的作用：
　　Ngb是新近發(fā)現的氧結合珠蛋白超家族成員,表達于神經系統(tǒng),具有抗氧化損傷作用。Ngb含有兩種重要的氨基酸:組氨酸和半胱氨酸,對Ngb的蛋白質結構及功能具有重要作用。為了探討Ngb的抗氧化作用及作用機制,使用hNgb轉基因線蟲來進行百草枯(paraquat,PQ)處理,結果顯示Ngb具有抗氧化作用。使用免疫共沉淀分析Ngb的相互作用蛋白,但未見明顯結果,有可能Ngb

3、是通過自身的重要結構來發(fā)揮抗氧化作用。還構建了Ngb的雙突變表達載體,進行顯微注射,以期獲得Ngb的突變株系,進一步探討Ngb抗氧化損傷的作用機制。
　　秀麗線蟲體內有33種globin,遠多于脊椎動物,其中glb-13是人源Ngb(hNgb)的同源物,氨基酸序列具有20％的相似性,有相同的功能域。為了探討glb-13的抗氧化作用及其發(fā)揮作用的信號通路,我們通過線蟲的交配構建了線蟲重要通路hif-1與daf-16和glb-13的雙

4、突變株系,并進行PQ處理來統(tǒng)計成蟲率,結果顯示glb-13(tm2825)突變株系不能恢復PQ引起的氧化損傷,hif-1的glb-13雙突變株系的抗氧化作用低于glb-13(tm2825),說明hif-1在glb-13抗氧化作用的信號通路上可能發(fā)揮重要作用。在mRNA水平上,glb-13表達水平上調,與其抗氧化表型吻合,glb-13具有抗氧化應激作用,而glb-13的抗氧化應激作用不受HIF-1調控,可能與DAF-16和Nrf-2相關。

5、同時,我們構建了以glb-13為啟動子的表達載體,通過EGFP的可視化顯示glb-13在線蟲體內的分布與表達,以期獲得其轉基因株系,從而從蛋白質水平探討glb-13的抗氧化作用。從Ngb的同源物角度進行Ngb的抗氧化作用研究,反映了Ngb具有抗氧化的作用,因此研究glb-13的功能對于理解Ngb的功能進化性具有重要意義。
　　2、利用秀麗線蟲研究細胞骨架蛋白在缺氧中的作用機制：
　　細胞骨架蛋白是支撐細胞的重要結構,不可或缺