利用秀麗線蟲研究Ngb的抗氧化損傷作用及細(xì)胞骨架蛋白的缺氧應(yīng)答機(jī)制.pdf

1、秀麗線蟲(Caenorhabditis elegans,C. elegans)是1974年Brenner首次公開報(bào)道的模式生物,其優(yōu)點(diǎn)很多,是進(jìn)行遺傳、基因研究方面的首選模式生物。線蟲生長(zhǎng)周期短,實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)簡(jiǎn)便,具備完整的發(fā)育和解剖學(xué)特征,已完成全基因組測(cè)序,基因操作便捷,如轉(zhuǎn)基因、基因突變、RNA干涉等。本研究將線蟲應(yīng)用于Ngb對(duì)氧化損傷的作用研究及缺氧狀態(tài)下細(xì)胞骨架的變化分析,旨在促進(jìn)對(duì)低氧應(yīng)答機(jī)制的理解及氧化應(yīng)激損傷保護(hù)的防護(hù)基礎(chǔ)

2、研究。
　　1、利用秀麗線蟲研究Ngb抗氧化損傷的作用：
　　Ngb是新近發(fā)現(xiàn)的氧結(jié)合珠蛋白超家族成員,表達(dá)于神經(jīng)系統(tǒng),具有抗氧化損傷作用。Ngb含有兩種重要的氨基酸:組氨酸和半胱氨酸,對(duì)Ngb的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能具有重要作用。為了探討Ngb的抗氧化作用及作用機(jī)制,使用hNgb轉(zhuǎn)基因線蟲來進(jìn)行百草枯(paraquat,PQ)處理,結(jié)果顯示Ngb具有抗氧化作用。使用免疫共沉淀分析Ngb的相互作用蛋白,但未見明顯結(jié)果,有可能Ngb

3、是通過自身的重要結(jié)構(gòu)來發(fā)揮抗氧化作用。還構(gòu)建了Ngb的雙突變表達(dá)載體,進(jìn)行顯微注射,以期獲得Ngb的突變株系,進(jìn)一步探討Ngb抗氧化損傷的作用機(jī)制。
　　秀麗線蟲體內(nèi)有33種globin,遠(yuǎn)多于脊椎動(dòng)物,其中g(shù)lb-13是人源Ngb(hNgb)的同源物,氨基酸序列具有20％的相似性,有相同的功能域。為了探討glb-13的抗氧化作用及其發(fā)揮作用的信號(hào)通路,我們通過線蟲的交配構(gòu)建了線蟲重要通路hif-1與daf-16和glb-13的雙

4、突變株系,并進(jìn)行PQ處理來統(tǒng)計(jì)成蟲率,結(jié)果顯示glb-13(tm2825)突變株系不能恢復(fù)PQ引起的氧化損傷,hif-1的glb-13雙突變株系的抗氧化作用低于glb-13(tm2825),說明hif-1在glb-13抗氧化作用的信號(hào)通路上可能發(fā)揮重要作用。在mRNA水平上,glb-13表達(dá)水平上調(diào),與其抗氧化表型吻合,glb-13具有抗氧化應(yīng)激作用,而glb-13的抗氧化應(yīng)激作用不受HIF-1調(diào)控,可能與DAF-16和Nrf-2相關(guān)。

5、同時(shí),我們構(gòu)建了以glb-13為啟動(dòng)子的表達(dá)載體,通過EGFP的可視化顯示glb-13在線蟲體內(nèi)的分布與表達(dá),以期獲得其轉(zhuǎn)基因株系,從而從蛋白質(zhì)水平探討glb-13的抗氧化作用。從Ngb的同源物角度進(jìn)行Ngb的抗氧化作用研究,反映了Ngb具有抗氧化的作用,因此研究glb-13的功能對(duì)于理解Ngb的功能進(jìn)化性具有重要意義。
　　2、利用秀麗線蟲研究細(xì)胞骨架蛋白在缺氧中的作用機(jī)制：
　　細(xì)胞骨架蛋白是支撐細(xì)胞的重要結(jié)構(gòu),不可或缺