熱休克蛋白90與細(xì)胞骨架蛋白在氧化應(yīng)激及預(yù)適應(yīng)中作用的探討.pdf

1、研究背景: 細(xì)胞代謝和外源性因素引起的細(xì)胞氧化/抗氧化平衡紊亂，損害脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸功能，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激，見(jiàn)于多種疾病中[1]。在細(xì)胞模型中，高溫、氧化劑處理可導(dǎo)致氧化應(yīng)激，與多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活機(jī)制有關(guān)[2,3]。另一方面，一定程度的氧化應(yīng)激，可增強(qiáng)細(xì)胞、機(jī)體適應(yīng)能力，并與某些應(yīng)激保護(hù)性蛋白的合成有關(guān)[4，5]。在眾多氧化應(yīng)激研究中對(duì)損傷機(jī)制已有較深入的研究，而對(duì)氧化應(yīng)激適應(yīng)的機(jī)制研究不夠，而這兩個(gè)環(huán)節(jié)是環(huán)境因素傷害作用

2、與機(jī)體抵御氧化應(yīng)激傷害應(yīng)答中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。氧化應(yīng)激適應(yīng)的生物學(xué)機(jī)制的探索，將有助于能闡明機(jī)體對(duì)應(yīng)激適應(yīng)的分子機(jī)制，為探討相關(guān)疾病的機(jī)理、疾病治療、疾病預(yù)防和新藥開(kāi)發(fā)提供重要的理論基礎(chǔ)。 氧化應(yīng)激狀態(tài)下機(jī)體蛋白質(zhì)表達(dá)譜研究的深入[6]為進(jìn)一步探討氧化應(yīng)激與適應(yīng)的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。SWISS-PORT蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中可檢索到220種與人類(lèi)應(yīng)激相關(guān)的蛋白質(zhì)。熱休克蛋白90(heatshockprotein，Hsp90)是公認(rèn)的與應(yīng)激適應(yīng)

3、密切相關(guān)的保護(hù)性分子，可在共作用伴侶蛋白(co-chaperones)的協(xié)助下，調(diào)節(jié)底物蛋白折疊、聚合來(lái)保護(hù)其生物功能；作為Hsp90底物蛋白的細(xì)胞骨架蛋白參與細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)并是維持細(xì)胞正常生理功能的關(guān)鍵分子，是氧化應(yīng)激損傷的早期靶目標(biāo)[7]。并有研究表明，Hsp90可穩(wěn)定骨架蛋白的聚合[8]，因此，探討兩者在氧化應(yīng)激預(yù)適應(yīng)中的共作用關(guān)系有助于闡明熱休克蛋白90作為應(yīng)激保護(hù)性分子的作用機(jī)制。 目的: 1.通過(guò)氧化

4、應(yīng)激和預(yù)適應(yīng)建立HepG2細(xì)胞Hsp90的差異表達(dá)模型[9]； 2.研究在氧化應(yīng)激和預(yù)適應(yīng)條件下，HepG2細(xì)胞活性和細(xì)胞內(nèi)Hsp90和骨架蛋白Tubulin、Vimentin的表達(dá)情況的關(guān)系； 3.分析骨架蛋白Tubulin、Vimentin和Hsp90在正常環(huán)境(對(duì)照組)、應(yīng)激、預(yù)適應(yīng)等不同狀態(tài)下的分布和量的變化趨勢(shì)，并以此進(jìn)一步探討熱休克蛋白在氧化應(yīng)激預(yù)適應(yīng)下對(duì)細(xì)胞保護(hù)作用的分子機(jī)制。 方法: 1.

5、建立預(yù)適應(yīng)及氧化應(yīng)激HepG2細(xì)胞模型：將細(xì)胞分為對(duì)照組(C)、氧化應(yīng)激組(O)、預(yù)適應(yīng)組(P)和預(yù)適應(yīng)后氧化應(yīng)激組(P+O)。預(yù)適應(yīng)因素：50μmol/L，H2O2，2h，普通培養(yǎng)基孵育10h，氧化應(yīng)激因素：500μmol/L，H2O2，24h。通過(guò)MTT比色法和Hoechst33342染色法測(cè)定和觀察不同條件下的細(xì)胞存活情況。 2.以Western-blot檢測(cè)不同條件下胞內(nèi)Hsp90及骨架蛋白Tubulin和Vimenti

6、n的差異表達(dá)情況。 3.應(yīng)用免疫熒光方法檢測(cè)不同情況下Hsp90及骨架蛋白Tubulin和Vimentin的分布情況。 結(jié)果: 1.MTT比色法測(cè)定細(xì)胞生存活力：氧化應(yīng)激明顯降低細(xì)胞生存活力(Ov.s.C；P+Ov.s.P，P<0.05)。預(yù)適應(yīng)可提高氧化應(yīng)激后的細(xì)胞生存活力(P+Ov.s.O，P<0.05)。 2.Heochst33342染色法觀察細(xì)胞凋亡結(jié)果：氧化應(yīng)激導(dǎo)致凋亡細(xì)胞明顯增多；預(yù)適應(yīng)可明顯

7、減少氧化應(yīng)激后凋亡細(xì)胞數(shù)。 3.預(yù)適應(yīng)和氧化應(yīng)激對(duì)Hsp90和Tubulin、Vimentin的表達(dá)量的影響：氧化應(yīng)激導(dǎo)致胞內(nèi)Hsp90、Tubulin和Vimentin表達(dá)量明顯降低(Ov.s.C，P<0.05)。預(yù)適應(yīng)可提高胞內(nèi)Hsp90、Tubulin和Vimentin表達(dá)量(Pv.s.C，P<0.05)，并在氧化應(yīng)激后維持較高水平(P+Ov.s.O，P<0.05)。 4.Hsp90和Tubulin、Vimenti

8、n有相似的細(xì)胞內(nèi)分布：不同條件下，體外培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞中Hsp90的分布與細(xì)胞骨架蛋白Tubulin和Vimentin一致。①對(duì)照組顯示了正常生理情況下Hsp90和Tubulin及Vimentin在細(xì)胞內(nèi)趨勢(shì)一致，均勻分布于胞漿和胞核；②而直接應(yīng)激組中兩種蛋白在胞漿中呈現(xiàn)一致的散在點(diǎn)狀分布，更多聚集于胞核周?chē)?，且總體密度小于對(duì)照組；③預(yù)適應(yīng)組兩種蛋白分布，光密度較對(duì)照組顯著增加，主要分布于胞漿；④預(yù)適應(yīng)后應(yīng)激組的光密度與預(yù)適應(yīng)組相比

9、在應(yīng)激后則輕微減弱，總的光密度和分布范圍略大于直接應(yīng)激組。 結(jié)論: 1.預(yù)適應(yīng)可增加細(xì)胞內(nèi)Hsp90的表達(dá)水平并改變其胞內(nèi)分布，從而減輕應(yīng)激引起的細(xì)胞形態(tài)和功能改變，實(shí)現(xiàn)再次應(yīng)激時(shí)的保護(hù)作用； 2.骨架蛋白Tubulin和Vimentin與應(yīng)激保護(hù)性分子Hsp90在正常環(huán)境(對(duì)照組)、應(yīng)激、預(yù)適應(yīng)等不同條件下的表達(dá)水平差異和分布的變化具有相同的趨勢(shì)，從而推測(cè)Hsp90可能通過(guò)協(xié)同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路平臺(tái)--骨架蛋白網(wǎng)絡(luò)與