益氣活血中藥對衰老血管內(nèi)皮細胞骨架蛋白的干預(yù)作用及機制研究.pdf

1、老齡化是人類面臨的世界性難題。有研究證實，即使在心血管疾病其他危險因素有效控制的情況下，心血管事件的發(fā)生率仍然會隨著年齡而增加，而這種差異與年齡相關(guān)的血管結(jié)構(gòu)和功能的改變相關(guān)，血管年齡是心血管事件和死亡率最好的預(yù)測因素。因此進行血管老化研究的意義不言而喻。血管老化的病變涉及內(nèi)膜、中膜和外膜。其中內(nèi)皮細胞生物學改變在血管老化中起到重要作用。細胞骨架是指細胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)纖維網(wǎng)架體系，與血管內(nèi)皮細胞的通透性、內(nèi)皮相關(guān)的血管舒縮功能、內(nèi)皮凋亡、

2、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等密切相關(guān)。因此本研究在前期研究的基礎(chǔ)上從細胞骨架層面對內(nèi)皮衰老的病理改變及益氣活血中藥的干預(yù)作用及機制進行分析。
　　第一部分:復(fù)制性衰老微血管內(nèi)皮細胞模型的建立及其細胞骨架的觀察
　　目的:觀察復(fù)制性衰老人心臟微血管內(nèi)皮細胞(human cardiac microvascularendothelial cells，HCMEC)的衰老特點，分析細胞骨架F-actin和G-actin的改變。
　　方法:采用體外

3、培養(yǎng)和傳代的方法建立復(fù)制性衰老模型，分別通過β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色鑒定衰老、CCK-8檢測細胞增殖能力、流式細胞儀分析細胞周期等方法觀察衰老改變，運用激光免疫共聚焦顯微鏡觀察復(fù)制衰老中細胞骨架F-actin和G-actin的改變。
　　結(jié)果:與5代細胞相比，8代HCMEC細胞體積增大，變得扁平，胞核明顯甚至雙核，胞漿內(nèi)顆粒增加，變渾濁;SA-β-gal衰老染色約占80％，符合衰老改變;細胞增殖能力降低;細胞停滯于G

4、0/G1期，S期和G2/M期細胞比例下降，表明8代HCMEC可以用于復(fù)制性衰老的實驗研究。5代HCMEC細胞F-actin主要分布在內(nèi)皮細胞邊緣，線條完整連續(xù)，顯示HCMEC典型的鵝卵石樣輪廓;G-actin主要分布在內(nèi)皮細胞中央?yún)^(qū)域，邊界較為清晰圓潤，呈致密圓形橢圓。8代HCMEC周邊完整連續(xù)的F-actin變得毛糙不規(guī)整，出現(xiàn)鋸齒樣斷裂，趨于崩解消散，部分形成應(yīng)力纖維;飽滿圓潤的G-actin向細胞周邊區(qū)域伸展移位，胞漿區(qū)出現(xiàn)散點狀

5、染色，部分邊界變模糊。G-actin向F-actin轉(zhuǎn)化增多，F(xiàn)/G-actin平均光密度比值下降。
　　結(jié)論:8代HCMEC細胞可以用于復(fù)制性衰老模型的實驗研究;復(fù)制性衰老HCMEC細胞骨架F-actin和G-actin的形態(tài)破壞，G-actin向F-actin轉(zhuǎn)化增多，應(yīng)力纖維形成。
　　第二部分:益氣活血中藥對復(fù)制性衰老微血管內(nèi)皮細胞改變及骨架蛋白的干預(yù)作用
　　目的:觀察人參三七川芎提取物延緩復(fù)制性衰老HCME

6、C的作用;分析對其細胞骨架F-actin和血管內(nèi)皮鈣黏蛋白(vascular endothelial cadherin，VE-cadherin)的干預(yù)作用。
　　方法:通過體外培養(yǎng)和傳代的方法建立復(fù)制性衰老HCMEC模型。實驗分為5代細胞組（青年組）、8代復(fù)制性衰老模型組（衰老組）、白藜蘆醇組(10μmol/Lresveratrol)、中藥低劑量組（50mg/L中藥提取液）、中藥中劑量組(100mg/L中藥提取液)、中藥高劑量組（

7、200mg/L中藥提取液）。采用SA-β-gal染色鑒定衰老、CCK-8檢測細胞增殖能力、流式細胞儀分析細胞周期，激光免疫共聚焦顯微鏡觀察細胞骨架F-actin和G-actin、VE-cadherin的改變，硝酸還原酶法檢測細胞上清NO的含量，Real-Time PCR和western-blot方法檢測各組細胞F-actin、VE-cadherin、熱休克蛋白27(heat shock protein27，HSP27)的mRNA和蛋白表

8、達情況。
　　結(jié)果:與衰老組相比，人參三七川芎提取物減少復(fù)制性衰老HCMEC細胞SA-β-gal染色的比例，促進細胞的增殖，促使細胞處于S和G2/M期，增加細胞上清NO的分泌;與白藜蘆醇組相比，人參三七川芎提取物促進細胞增殖和減少G0/G1期細胞比例。與衰老組相比，人參三七川芎提取物使復(fù)制性衰老HCMEC骨架蛋白F-actin線條較為完整的分布于細胞邊緣，G-actin圓潤飽滿的分布于細胞中央，VE-cadherin連接較為完整的

9、分布于細胞周邊，F(xiàn)/G-actin和VE-cadherin的平均光密度值增加。與衰老組相比，人參三七川芎提取物減少F-actin的蛋白表達，增加VE-cadherin、HSP27的蛋白表達;與白藜蘆醇相比，人參三七川芎提取物高劑量組VE-cadherin增多。
　　結(jié)論:人參三七川芎提取物可以延緩微血管內(nèi)皮細胞的衰老和保持內(nèi)皮細胞功能，機制可能與F-actin下調(diào)、VE-cadherin和HSP27上調(diào)有關(guān)。
　　第三部分:

10、益氣活血中藥對衰老微血管內(nèi)皮細胞F-actin、VE-cadherin作用機制探討
　　目的:分析人參三七川芎提取物對復(fù)制性衰老HCMEC細胞骨架F-actin和VE-cadherin的干預(yù)機制。
　　方法:運用慢病毒感染的方法，建立HSP27沉默后復(fù)制性衰老HCMEC細胞模型。分組為Mock組、未敲低細胞（衰老組、白藜蘆醇組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組）、基因敲低細胞（HSP27shRNA組（衰老組）、HSP

11、27shRNA+白藜蘆醇組、HSP27shRNA+中藥低劑量組、HSP27shRNA+中藥中劑量組、HSP27shRNA+中藥高劑量組）。采用SA-β-gal染色鑒定衰老、CCK-8檢測細胞增殖能力、流式細胞儀分析細胞周期，激光免疫共聚焦顯微鏡觀察細胞骨架F-actin和G-actin、VE-cadherin的改變，硝酸還原酶法檢測細胞上清NO的含量，Real-Time PCR和western-blot方法檢測各組細胞F-actin、V

12、E-cadherin的mRNA和蛋白表達情況。
　　結(jié)果:分別與Mock組、未敲低組比較，HSP27基因敲低后人參三七川芎提取物組細胞SA-β-gal染色比例增加，增殖能力下降;F-actin外周致密帶邊緣變得毛糙不規(guī)整，崩解消散，細胞的形狀不能清晰的呈現(xiàn);G-actin表現(xiàn)為邊緣變模糊呈絮狀向外延伸，而細胞中央?yún)^(qū)域染色離散，形態(tài)不規(guī)則，F(xiàn)/G-actin的平均光密度值下降;VE-cadherin環(huán)狀連接消失，出現(xiàn)大量斷裂，染色不

13、清晰，平均光密度值降低;F-actin、VE-cadherin的蛋白表達明顯下降。
　　結(jié)論:人參三七川芎提取物通過HSP27下調(diào)F-actin、上調(diào)VE-cadherin延緩微血管內(nèi)皮細胞衰老。
　　綜上所述，8代HCMEC可以用于復(fù)制性衰老模型的實驗研究，且細胞骨架F-actin出現(xiàn)形態(tài)粗糙、鋸齒樣斷裂、應(yīng)力纖維，飽滿圓潤的G-actin向細胞周邊區(qū)域伸展移位、胞漿區(qū)出現(xiàn)散點狀染色、邊界不清晰。人參三七川芎提取物減少復(fù)制