Egr-1經(jīng)骨橋蛋白致大鼠頸總動(dòng)脈球囊損傷后內(nèi)膜增生的作用機(jī)制研究.pdf

1、前言：
　　經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(percutaneous coronary interventions，PCI)術(shù)的臨床應(yīng)用為冠心病的治療開辟了新的領(lǐng)域，但PCI術(shù)后血管重建部位再狹窄(restenosis，RS)的發(fā)生嚴(yán)重影響了其遠(yuǎn)期療效。動(dòng)脈損傷后狹窄的形成是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過程，血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)的遷移、過度增殖和細(xì)胞外基質(zhì)大量合成是導(dǎo)致血管內(nèi)膜增厚管腔狹窄

2、的主要原因。因此尋找有效的手段抑制新生內(nèi)膜形成是預(yù)防再狹窄的主要措施之一。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基因治療再狹窄可能是一種很有前景的治療方法。脫氧核酶(deoxyribozyme，DRz)是一種具有酶催化活性的DNA分子，作為一種基因抑制劑有著實(shí)際的治療作用。小干擾RNA(small interference RNA，siRNA)通過同其靶信使RNA作用在轉(zhuǎn)錄后水平抑制基因表達(dá)。
　　研究表明，某些轉(zhuǎn)錄因子(transcriptio

3、n factors，TF)可以調(diào)節(jié)多個(gè)VSMC增殖相關(guān)基因的表達(dá)，從不同層面調(diào)控VSMC的遷移與增殖。同時(shí)，人們也逐漸注意到細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)在血管重塑過程中的重要地位，ECM是新生內(nèi)膜的主要成分及參與再塑形的主要元素，調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，是形成再狹窄的主要物質(zhì)。TF與ECM在介導(dǎo)VSMC增殖、遷移的過程中密不可分，將二者有機(jī)地聯(lián)系在一起，并對(duì)其相互作用關(guān)系進(jìn)行深入探討，將有助于全面了

4、解血管重塑的細(xì)胞與分子機(jī)制。
　　早期生長(zhǎng)反應(yīng)因子-1(early growth response factor-1，Egr-1)是一種即刻早期基因產(chǎn)物和鋅指結(jié)構(gòu)TF，也是一種DNA結(jié)合蛋白，可以與富含GC的序列結(jié)合而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn)，Egr-1調(diào)控著多種與細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，從而誘導(dǎo)VSMC的分裂、增殖和內(nèi)膜增生，因此與細(xì)胞增殖關(guān)系密切。
　　骨橋蛋白(osteopontin，OPN)作為ECM中一種重要的功能性蛋白

5、，研究表明，OPN在大鼠血管損傷后新生內(nèi)膜中的表達(dá)明顯上調(diào)，而且能促進(jìn)VSMC、外膜細(xì)胞的遷移，被認(rèn)為是血管損傷修復(fù)過程中的始動(dòng)因素。研究發(fā)現(xiàn)，許多參與PCI術(shù)后RS的細(xì)胞因子均能夠刺激VSMC過度表達(dá)OPN，提示OPN參與RS的形成，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用抗OPN抗體可以抑制VSMC的表型轉(zhuǎn)化、增殖和遷移，進(jìn)而抑制RS的形成。
　　Egr-1和OPN在介導(dǎo)VSMC遷移、增殖過程中均起著重要的作用，密不可分。本課題組在細(xì)胞水平首次證實(shí)了E

6、gr-1與OPN之間存在著正相關(guān)性，Egr-1能夠與OPN啟動(dòng)子結(jié)合調(diào)控其轉(zhuǎn)錄表達(dá)，同時(shí)，OPN也可以通過ERK途徑正反饋上調(diào)Egr-1表達(dá)，二者形成一個(gè)作用級(jí)聯(lián)放大的正反饋環(huán)。為了在動(dòng)物水平驗(yàn)證Egr-1與OPN的相關(guān)性及相互作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)擬在以往研究的基礎(chǔ)上，在大鼠頸總動(dòng)脈球囊損傷模型上，分別轉(zhuǎn)染ED5及OPN siRNA，觀察轉(zhuǎn)染前后OPN與Egr-1的表達(dá)變化分析二者的相關(guān)性并通過染色質(zhì)免疫共沉淀(chromatin immu

7、noprecipitation，ChIP)方法檢測(cè)Egr-1與OPN啟動(dòng)子的結(jié)合情況，同時(shí)通過加入細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)磷酸化抑制劑PD98059，檢測(cè)抑制ERK磷酸化后，OPN上調(diào)Egr-1的水平變化，從而對(duì)二者相互調(diào)控的內(nèi)在機(jī)制進(jìn)行驗(yàn)證。同時(shí)觀察將OPN siRNA轉(zhuǎn)染球囊損傷的大鼠頸總動(dòng)脈后，檢測(cè)下游增殖基因（增殖細(xì)胞核抗原，proliferat

8、ing cell nuclear antigen，PCNA及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1，transforming growth factorβ1，TGF-β1）、遷移基因(matrix metalloproteinases:基質(zhì)金屬蛋白酶2，MMP-2及基質(zhì)金屬蛋白酶14，MMP-14)的表達(dá)變化，從而進(jìn)一步驗(yàn)證OPN siRNA抑制RS的作用。
　　材料與方法：
　　1、主要試劑
　　Egr-1特異脫氧核酶(DNAenzyme

9、/10-23 DRz，ED5)，由Invitrogen USA合成。在其3'和5'端進(jìn)行硫代修飾，5'端用FITC標(biāo)記，以便于在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后基因的分布情況。
　　由廣州銳博生物科技有限公司設(shè)計(jì)與合成3對(duì)OPN siRNA，同時(shí)合成1對(duì)與OPN基因序列無關(guān)的siRNA(SCR-siRNA)作為陰性對(duì)照和檢驗(yàn)RNAi有效性的指標(biāo)，所有siRNA序列進(jìn)行甲基化修飾增加穩(wěn)定性，部分SCR-siRNA的5'端用Cy3標(biāo)記，以便于觀

10、察轉(zhuǎn)染后基因的分布情況。
　　2、VSMC原代培養(yǎng)及鑒定
　　采用組織塊貼壁法行大鼠平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)，小鼠抗大鼠α-SM-actin單克隆抗體免疫熒光鑒定。
　　3、OPN siRNA的篩選
　　實(shí)驗(yàn)設(shè)置陰性siRNA組（轉(zhuǎn)染SCR組）及陽性siRNA組(轉(zhuǎn)染001 siRNA，轉(zhuǎn)染002siRNA，轉(zhuǎn)染003siRNA)。使用Fugene6轉(zhuǎn)染OPN siRNA進(jìn)入平滑肌細(xì)胞，應(yīng)用實(shí)時(shí)

11、RT-PCR檢測(cè)siRNA轉(zhuǎn)染后VSMC的OPN mRNA的表達(dá)。
　　4、大鼠頸總動(dòng)脈損傷模型的制作
　　健康雄性Wistar大白鼠，體重350-400 g，10％水合氯醛(300mg/kg)麻醉后，頸正中切開，鈍性分離左頸總動(dòng)脈，血管夾暫時(shí)阻斷左頸總動(dòng)脈近心、遠(yuǎn)心端血流，用1.5mm球囊導(dǎo)管從頸外動(dòng)脈插入左頸總動(dòng)脈內(nèi)，施以3-4atm壓力，然后回拉球囊至分叉處重復(fù)3次，造成左頸總動(dòng)脈內(nèi)膜損傷。
　　5、實(shí)驗(yàn)分組及處

12、理
　　(1)126只雄性Wistar大白鼠，隨機(jī)分為7組，每組18只，每組再按術(shù)后3、7、14天分為3個(gè)亞組，每亞組6只。
　　在體ED5轉(zhuǎn)染:球囊拉傷后，將200μl轉(zhuǎn)染復(fù)合物（含有FITC-ED5500μg、轉(zhuǎn)染試劑Fugene630μl及1 mmol/L MgCl2溶液）注入至損傷的血管節(jié)段內(nèi)，局部孵育20min。
　　在體OPN-RNAi轉(zhuǎn)染:球囊拉傷后，將200μl轉(zhuǎn)染復(fù)合物（含有Cy3-OPNSCR-si

13、RNA15μg的30％pluronic gel溶液）注射至損傷的血管周圍，結(jié)扎頸外動(dòng)脈，縫合頸部創(chuàng)口。
　　MgCl2對(duì)照組:球囊拉傷頸總動(dòng)脈后，局部注入200μl的1 mmol/L MgCl2液;Fugene6對(duì)照組:球囊拉傷頸總動(dòng)脈后，局部注入200μl含F(xiàn)ugene630μl的1 mmol/LMgCl2液;ED5轉(zhuǎn)染組:球囊拉傷頸總動(dòng)脈后，局部釋放200μl轉(zhuǎn)染復(fù)合物（含F(xiàn)ugene630μl+ ED5500μg的1mmol

14、/L MgCl2溶液），以上三組均局部作用20分鐘;
　　Pluronic gel對(duì)照組:球囊拉傷頸總動(dòng)脈后，損傷血管周圍釋放200μl的30％pluronic gel溶液;OPN SCR-siRNA轉(zhuǎn)染組:球囊拉傷頸總動(dòng)脈后，損傷血管周圍釋放200μl含OPN SCR-siRNA15μg的30％pluronic gel溶液;OPN siRNA轉(zhuǎn)染組:球囊拉傷頸總動(dòng)脈后，損傷血管周圍釋放200μl含OPN-siRNA15μg的30

15、％Pluronic gel溶液;
　　假手術(shù)組:只進(jìn)行頸外動(dòng)脈結(jié)扎，但不插入導(dǎo)管。
　　術(shù)后第3、7、14天分批處死動(dòng)物，取病變處血管生理鹽水沖洗后，分別置于4％多聚甲醛和液氮中，用于HE染色、免疫組化、real-time RT-PCR及Western blot檢測(cè)。
　　(2)20只雄性Wistar大白鼠，以單純球囊擴(kuò)張側(cè)血管為實(shí)驗(yàn)組，對(duì)側(cè)血管為對(duì)照組。
　　術(shù)后14d處死動(dòng)物，分別取實(shí)驗(yàn)組病變處及對(duì)照組對(duì)應(yīng)部

16、位血管，生理鹽水沖洗后，置于液氮中，用于ChIP方法檢測(cè)。
　　(3)90只雄性Wistar大白鼠，隨機(jī)分為5組（假手術(shù)組、DMSO對(duì)照組、OPNsiRNA轉(zhuǎn)染組、PD98059處理組及OPN siRNA轉(zhuǎn)染+PD98059處理組），每組18只，每組再按術(shù)后3、7、14天分為3個(gè)亞組，每亞組6只。
　　假手術(shù)組:只進(jìn)行頸外動(dòng)脈結(jié)扎，但不插入導(dǎo)管;DMSO對(duì)照組:球囊拉傷頸總動(dòng)脈后，血管損傷局部立即給予200ul DMSO液孵

17、育20分鐘;OPN siRNA轉(zhuǎn)染組:球囊拉傷頸總動(dòng)脈后，損傷血管周圍釋放200μl含OPN siRNA15μg的30％pluronic gel溶液;PD98059處理組:球囊拉傷頸總動(dòng)脈后，血管損傷局部立即給予200ul含100ug PD98059的DMSO液孵育20分鐘;OPN siRNA轉(zhuǎn)染+PD98059處理組:球囊拉傷頸總動(dòng)脈后，血管損傷局部立即給予200ul DMSO液孵育20分鐘，損傷血管周圍釋放200μl含OPN siR

18、NA15μg的30％pluronic gel溶液。
　　術(shù)后第3、7、14天分批處死動(dòng)物，取病變處血管生理鹽水沖洗后，置于液氮中用于Western blot檢測(cè)。
　　6、免疫組織化學(xué)法檢測(cè)OPN、PCNA、TGF-β1、MMP-2、MMP-14的蛋白表達(dá)
　　7、real-time RT-PCR法測(cè)定VSMC的OPN mRNA及血管壁組織的Egr-1、OPN、PCNA、TGF-β1、 MMP-2、MMP-14 mRN

19、A表達(dá)
　　8、Western blot檢測(cè)Egr-1、OPN、PCNA、TGF-β1、MMP-2、MMP-14、ERK、P-ERK蛋白含量表達(dá)
　　9、ChIP方法檢測(cè)Egr-1與OPN啟動(dòng)子的結(jié)合
　　10、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　所有數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±SD)表示，不同組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，Egr-1及OPN相關(guān)性用雙變量相關(guān)

20、分析法(Spearman相關(guān)分析)，p＜0.05為差異有顯著性。
　　結(jié)果：
　　1、體外培養(yǎng)的大鼠VSMC的鑒定
　　組織塊貼壁法培養(yǎng)5-7天后可見原代細(xì)胞從組織塊邊緣爬出，3-4周后可長(zhǎng)成單層融合細(xì)胞，呈VSMC的典型“峰-谷”狀生長(zhǎng)。VSMC特異性標(biāo)志蛋白α-SM-actin免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽性。
　　2、VSMC real-time RT-PCR的結(jié)果
　　OPN002 siRNA轉(zhuǎn)染后的VSMC的

21、OPN mRNA顯著降低，沉默效應(yīng)最好，與OPN SCR-siRNA對(duì)照組相比，沉默了76.86％，OPN002 siRNA組抑制效果最明顯，被選出做進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。
　　3、在體基因轉(zhuǎn)染效果觀察
　　分別于轉(zhuǎn)染治療基因FITC-ED524小時(shí)及Cy3-OPN SCR-siRNA72小時(shí)后，取治療局部血管的冰凍切片置于熒光顯微鏡下，分別用480hm、550 nm光激發(fā)可見殘存血管內(nèi)膜及中膜有大量綠色、紅色熒光分布，證明轉(zhuǎn)染成功。

22、
　　4、血管病理形態(tài)學(xué)檢測(cè)結(jié)果
　　光鏡下可見:在假手術(shù)組，大鼠頸總動(dòng)脈內(nèi)膜完整;在Fugene6組、MgCl2對(duì)照組、Pluronic gel對(duì)照組及OPN SCR-siRNA轉(zhuǎn)染組，7d時(shí)可見內(nèi)膜增生，14d時(shí)內(nèi)膜明顯增生，ED5組與同一時(shí)間點(diǎn)Fugene6組及MgCl2對(duì)照組相比，OPN002siRNA組與同一時(shí)間點(diǎn)30％Pluronic gel對(duì)照組及OPN SCR-siRNA轉(zhuǎn)染組相比，內(nèi)膜增生受到抑制(p＜0.

23、001)。
　　5、OPN002 siRNA調(diào)節(jié)下游基因表達(dá)
　　(1)OPN、PCNA、TGF-β1、MMP-2、MMP-14免疫組化結(jié)果
　　在假手術(shù)組， PCNA不表達(dá)，OPN、TGF-β1、MMP-2、MMP-14僅微弱表達(dá);血管球囊損傷后3、7和14天，血管壁內(nèi)膜和中膜的細(xì)胞胞漿及胞核中有棕黃色顆粒，并逐漸增多，經(jīng)OPN002 siRNA治療后，同一時(shí)間點(diǎn)陽性細(xì)胞表達(dá)明顯減少，與OPN SCR-siRNA轉(zhuǎn)染

24、組及Pluronic gel對(duì)照組比較差異有顯著性(p＜0.001)。
　　(2)real-time RT-PCR檢測(cè)結(jié)果
　　在假手術(shù)組，PCNA mRNA不表達(dá)，OPN、TGF-β1、MMP-2、MMP-14 mRNA僅微弱表達(dá);血管球囊損傷后，OPN、PCNA、TGF-β1、MMP-2、MMP-14 mRNA表達(dá)明顯升高:OPN、TGF-β1 mRNA隨時(shí)間的延長(zhǎng)持續(xù)升高;MMP-14 mRNA表達(dá)3天達(dá)峰;PCNA、

25、MMP-2 mRNA表達(dá)7天達(dá)峰。經(jīng)OPN002 siRNA治療后，同一時(shí)間點(diǎn)OPN、PCNA、TGF-β1、MMP-2、MMP-14 mRNA表達(dá)明顯減少，與SCR-siRNA轉(zhuǎn)染及Pluronic gel對(duì)照組比較差異有顯著性(p＜0.001)。
　　(3)Western blot檢測(cè)結(jié)果
　　在假手術(shù)組，無PCNA蛋白條帶，OPN、TGF-β1、MMP-2、MMP-14有微弱蛋白條帶表達(dá);然而，血管球囊損傷3、7、14

26、d后，OPN、PCNA、TGF-β1、MMP-2、MMP-14蛋白條帶灰度均逐漸增加，MMP-14表達(dá)3天最明顯，PCNA、MMP-2表達(dá)7天最明顯，OPN、TGF-β114天最明顯。經(jīng)OPN002 siRNA治療后，同一時(shí)間點(diǎn)OPN、PCNA、TGF-β1、MMP-2、MMP-14表達(dá)明顯減少，與OPN SCR-siRNA轉(zhuǎn)染及Pluronic gel對(duì)照組比較差異有顯著性(p＜0.001)。
　　6、在大鼠頸總動(dòng)脈球囊損傷模型

27、，雙變量相關(guān)性分析結(jié)果
　　Egr-1與OPN的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平上呈正相關(guān)性(r=0.886，p＜0.001，n=18);同時(shí)，Egr-1與OPN的表達(dá)在翻譯水平上呈正相關(guān)性(r=0.765，p＜0.001，n=18)。
　　7、ChIP方法檢測(cè)Egr-1與OPN啟動(dòng)子的結(jié)合
　　在正常對(duì)照組的OPN基因啟動(dòng)子區(qū)域存在一定的Egr-1水平，相對(duì)富集率為0.1972;單純球囊擴(kuò)張14天后，OPN基因啟動(dòng)子區(qū)域的Egr-1水

28、平大增，相對(duì)富集率為0.7981，表明OPN基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子區(qū)域存在(—)Egr-1的結(jié)合位點(diǎn)。
　　8、Western blot法檢測(cè)OPN、Egr-1、ERK及P-ERK蛋白含量變化，分析它們之間的相互作用關(guān)系
　　DMSO組與同一時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組比較，OPN、P-ERK/ERK及Egr-1有所升高;OPN002 siRNA轉(zhuǎn)染組與同一時(shí)間點(diǎn)DMSO組比較，OPN、P-ERK/ERK及Egr-1均減少;PD98059處理組與

29、同一時(shí)間點(diǎn)DMSO組比較，P-ERK/ERK及Egr-1均減少;OPN002 siRNA轉(zhuǎn)染+PD98059處理組與OPN002 siRNA轉(zhuǎn)染組及PD98059處理組比較，P-ERK/ERK及Egr-1均明顯減少(p＜0.001)，表明PD98059可以有效抑制ERK的磷酸化，阻斷OPN對(duì)Egr-1的上調(diào)。
　　結(jié)論：
　　1、OPN002 siRNA明顯抑制平滑肌細(xì)胞中OPN的mRNA表達(dá)，具有RNAi作用。
　　

30、2、在大鼠頸總動(dòng)脈球囊損傷模型中，OPN002 siRNA可成功轉(zhuǎn)染。
　　3、在大鼠頸總動(dòng)脈球囊損傷模型中，OPN002 siRNA可有效地抑制下游增殖基因(PCNA、TGF-β1)及遷移基因(MMP-2、MMP-14)的表達(dá)。
　　4、在大鼠頸總動(dòng)脈球囊損傷模型中，Egr-1無論在轉(zhuǎn)錄水平還是在翻譯水平均可影響OPN的表達(dá);同樣，OPN也可以影響Egr-1的表達(dá)，二者的表達(dá)呈正相關(guān)性。
　　5、在大鼠頸總動(dòng)脈球囊損