A20基因對大鼠頸動脈球囊損傷后內膜增生的影響及其分子機制的研究.pdf

1、目的：經皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI)是治療冠心病的有效手段，但是再狹窄(restenosis，RS)仍是制約這一技術應用的主要問題。大量研究證實，再狹窄的機制主要由于球囊擴張和支架置入時導致血管壁損傷，引起炎癥反應，進而導致平滑肌細胞的增殖和移行。由于血管壁的機械性損傷所致的炎性和增殖效應是造成再狹窄的主要原因，多種生長因子、細胞因子、粘附分子等參與其病理生理過程，單

2、純抑制某種特定的因子并不能完全抑制病灶形成。因此，阻斷由炎癥損傷引起的平滑肌細胞增殖、分化、遷移等最終共同通路的關鍵基因成為有效防止再狹窄的研究方向。 基于導管將基因準確地送至狹窄血管的局部進行基因治療是預防血管再狹窄較有效的方法之一，而選擇合適的基因和載體是基因治療再狹窄的關鍵之一。 近年來在細胞內源性保護機制的研究中發(fā)現(xiàn)了一類新的蛋白質，即鋅脂蛋白A20(zinc finger protein A20)，簡稱A20。

3、A20是NF-κB信號系統(tǒng)重要的負反饋調節(jié)因子，也是防止體內炎癥反應失控的重要調節(jié)蛋白。A20的表達能夠被LPS和TNF等所誘導，是NF-κB信號系統(tǒng)活化的產物，同時A20通過抑制TNF和LPS刺激TNFR-1和TLR4誘導的NF-κB的活化而對細胞損傷起保護作用。已有研究證實NF-κB的激活是球囊損傷動脈后血管狹窄發(fā)生的重要機制之一。結構研究顯示，A20既有去泛素活性，又有泛素連接酶活性，是一種重要的泛素調節(jié)酶，在A20等泛素調節(jié)酶的

4、作用下泛素調節(jié)參與了NF-κB前體的處理、NF-κB抑制性結合蛋白IκB的降解和IkB激酶IKK的活化等主要環(huán)節(jié)，反饋抑制了NF-κB的活化。 一方面由于再狹窄的炎癥機制及A20調控炎癥的機制，另一方面由于NF-KB的激活導致球囊損傷后血管狹窄及A20對NF-kB活化的負反饋抑制作用，由此我們選擇A20基因作為再狹窄發(fā)生發(fā)展過程中的干預靶點，運用基因治療方法對體內A20的表達進行調控，深入探討球囊損傷術后血管內膜增生過程中A20

5、在損傷局部組織中的表達變化及局部過表達．A20對損傷后內膜增生、平滑肌細胞增殖和表型改變，內皮再生及TLR4/NF-kB信號通路的影響，為進一步明確A20對再狹窄過程中炎癥反應的調節(jié)作用以及揭示機體內源性保護機制提供必要的理論依據(jù)。 方法： 1．pCAGGS-GFP/A20重組質粒的鑒定和大量提取：將獲得的pCAGGS-GFP/A20質粒菌保涂Amp抗性的平板后，過夜培養(yǎng)。挑單菌落于3ml Amp抗性的LB培養(yǎng)基中37℃

6、搖床中過夜培養(yǎng)，集菌后，進行小量質粒提取，并使用EcoR V/Sma I進行雙酶切鑒定，酶切產物1％瓊脂糖凝膠電泳。將鑒定好的質粒菌保進行無內毒素質粒的大量提取，將質粒DNA提取物按適當比例稀釋，并測定濃度。 2．動物模型制備和實驗分組，大鼠頸總動脈內膜球囊剝脫術用來建立再狹窄模型：健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠體重350～400g，104只隨機分為4組(n=26)：假手術組；模型組(單純損傷組)；對照組(pC

7、AGGS-GFP+轉染試劑組)；治療組(pCAGGS-GFP/A20+轉染試劑組)。10％水合氯醛(3ml/kg)腹腔注射麻醉后，取頸正中切口，鈍性分離左頸總動脈，暴露左頸總動脈及其分叉處，用顯微血管夾暫時夾閉左頸總動脈近心端及頸內動脈，將2F Fogarty球囊導管從頸外動脈切口插入至左頸總動脈，用500μl生理鹽水充盈球囊，來回抽動3次以剝脫頸總動脈內膜。退出球囊，治療組向損傷血管節(jié)段內緩慢注入灌注液(Lipofectamine 2

8、000轉染試劑40μl+pCAGGS-GFP/A20質粒200μl)，對照組向損傷血管節(jié)段內緩慢注入灌注液(Lipofectamine 2000轉染試劑400μl+pCAGGS-GFP質粒200μl)局部作用30分鐘。模型組只進行球囊損傷術，假手術組只進行左頸外動脈結扎，不進行球囊損傷。術后不同時間點根據(jù)不同要求分別處死動物。轉染后24h取大鼠局部血管進行冰凍切片熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達籍以評估A20在損傷動脈壁的轉染效率；術

9、后1 4d病理組織學方法進行內膜增生的形態(tài)學分析；術后10d溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)標記技術評估血管平滑肌細胞(VSMC)的增殖指數(shù)；術后10d免疫組織化學染色觀察A20、核因子-kB p65(NF-kB p65)、Toll樣受體4(TLR4)在各組大鼠頸總動脈中的表達情況；術后3d、7d、14d、28d通過逆轉錄．聚合酶鏈式反應(RT-PCR)、Western-blotting法分別檢測A20、NF-kB p65、TLR4在頸動脈

10、組織的mRNA和蛋白表達。 3．健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠體重350～400g，36只隨機分為3組(n=12)：假手術組；對照組(pCAGGS-GFP+轉染試劑組)；治療組(pCAGGS-GFP/A20+轉染試劑組)。球囊損傷后2周伊文思藍(Evansblue)染色法評估內皮再生情況；術后3d、7d透射電鏡觀察血管超微結構改變。 4．體外培養(yǎng)大鼠主動脈平滑肌細胞并鑒定，以LPS(20mg/1)作為刺

11、激因素，以不同濃度大黃素(Emodin，EMD)作為干預因素，通過MTT和BrdU摻入方法評估各組VSMC增殖情況，以RT-PCR檢測A20 mRNA表達，以Western-blotting法檢測A20、NF-κB p65蛋白的表達。 結果： 1．將提取的重組真核表達質粒pCAGGS-GFP/A20使用EcoR V/Sma Ⅰ進行雙酶切鑒定，酶切產物1％瓊脂糖凝膠電泳，質粒大小及酶切結果正確。 2．將pCAGGS

12、-GFP/A20于活體轉染至大鼠球囊損傷的頸動脈局部，24h后熒光顯微鏡下可見治療組殘存血管內膜及中膜有大量綠色熒光分布，證明轉染成功。 3．大鼠頸總動脈球囊損傷術后14d模型組和對照組血管內膜顯著增生。A20基因轉染可顯著抑制新生內膜面積的增加(減少47.8％，P<0.05)和內/中膜比值的增加(減少42.9％，P<0.05)。術后10d治療組VSMC體內增殖指數(shù)(BrdU指數(shù))(9.6±2.3％)顯著少于對照組(26.7±5

13、.1％，P<0.01)。術后10d治療組血管壁A20免疫組化染色陽性細胞率顯著高于對照組(P<0.05)，NF-κB p65、TLR4免疫組化染色陽性細胞率顯著低于對照組(P<0.05)。術后3d、7d、14d、28d治療組血管組織A20的mRNA和蛋白表達量顯著高于對照組(P<0.05)，治療組血管組織NF-κBp65、TLR4的mRNA和蛋白表達量顯著低于對照組(P<0.05)。 4．球囊損傷后2周，pCAGGS-GFP/A

14、20質粒轉染治療組與對照組比較，顯示更大面積的內皮修復，由伊文思藍染色證明。治療組再內皮化的面積占最初損傷面積的百分數(shù)(73.1±3.7％)顯著大于對照組(55.6±3.3％，P<0.05)。說明A20轉染治療組與對照組比較顯示更大面積的內皮修復。 5．假手術組大鼠VSMC電鏡下呈典型的“收縮表型”，球囊損傷后7d對照組VSMC表型發(fā)生明顯改變，呈典型的“合成表型”，損傷后3d對照組可見合成型細胞及過渡型細胞，治療組術后7d 。

15、見接近收縮型的VSMC。 6．體外培養(yǎng)的大鼠主動脈VSMC經LPS刺激后，MTT OD值與BrdU摻入OD值均顯著高于空白組。經不同濃度EMD干預結果顯示隨EMD濃度增大，MTT OD值及BrdU摻入OD值均逐漸變小，其中低劑量組與對照組相比無顯著性差異(P>0.05)，高劑量組與對照組相比存在顯著性差異(P<0.05)。RT-PCR和Western-blot結果顯示LPS刺激可使A20mRNA和蛋白以及NF-kB p65蛋白表

16、達均增加，經不同濃度EMD干預后A20mRNA和蛋白表達隨EMD濃度遞增而進一步增加，NF-kB p65蛋白表達隨EMD濃度遞增而逐漸減少。 結論： 1．大鼠頸動脈球囊損傷后內源性鋅指蛋白A20在局部表達增加，并具有明顯的時效性，說明損傷情況下，A20表達增加是機體的一種重要的內源性抗炎保護效應機制，可能對于調控損傷后適度的炎癥反應具有重要意義。 2．大鼠頸動脈球囊損傷后局部轉染A20基因可獲得鋅指蛋白A20mR

17、NA和蛋白在局部組織細胞內高表達。 3．大鼠頸動脈球囊損傷后局部轉染A20基因可抑制損傷血管內膜增生及平滑肌細胞的增殖，其分子機制可能通過其負反饋抑制了TLR4/NF-kB介導的胞內信號轉導途徑。 4．大鼠頸動脈球囊損傷后局部轉染A20基因可促進損傷血管內皮再生，抑制損傷處VSMC表型轉化，其分子機制可能通過其負反饋抑制了TLR4/NF-KB介導的胞內信號轉導途徑。 5．EMD對LPS誘導的大鼠主動脈VSMC增殖