慢性胃食管反流病動物模型制備與HO-1在食管和肺組織中的表達(dá)及作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：首先探討保留全胃的3種不同類型胃食管反流大鼠模型的制備方法，旨在為研究胃酸、十二指腸液(主要為膽汁)及混合反流的作用機(jī)制及治療提供較理想的慢性反流動物模型。在成功制備動物模型基礎(chǔ)上進(jìn)一步觀察大鼠肺部的組織學(xué)改變并研究血紅素加氧酶-1(HO-1)、NOS2在食管及肺部組織中的表達(dá)，再通過分組予以HO-1抑制劑和誘導(dǎo)劑干預(yù)，以探討HO-1在GERD發(fā)生發(fā)展機(jī)制中的作用。 方法：首先選擇123只成年、SD雄性大鼠進(jìn)行實驗。造模時

2、體重230±30g，動物被隨機(jī)分成4組：假手術(shù)組(SO)、胃液反流為主(GER)模型組、十二指腸液反流為主(DER)模型組和十二指腸胃食管反流(DGER)模型組。SO組20只在常規(guī)開腹后游離食管下段和十二指腸，15分鐘后關(guān)腹。GER模型組先采用幽門部分縫扎+賁門肌切開術(shù)制備模型9只(GER1)，因術(shù)后1周內(nèi)死亡8只而放棄。后改行食管胃底吻合術(shù)制備模型20只(GER2)。DER模型組首先采用食管胃空腸側(cè)側(cè)吻合術(shù)制備模型3只(DER1)，亦

3、因術(shù)后動物短期死亡而改為食管十二指腸(膽管開口遠(yuǎn)側(cè))吻合術(shù)制備模型21只(DER2)。DGER模型組采用食管胃十二指腸吻合術(shù)(EGDA)制備胃十二指腸液混合反流47只。術(shù)后存活動物給與顆粒飼料喂養(yǎng)，每周測量體重，觀察營養(yǎng)狀態(tài)。于術(shù)后喂養(yǎng)1個月、2個月、3個月、4個月各組分批(每次3～5只/組)經(jīng)股靜脈放血處死并觀察食管局部大體形態(tài)變化，隨之取動物食管和肺組織標(biāo)本，部分以10％中性甲醛固定，制備組織切片，HE染色光鏡下觀察病理組織學(xué)改變，

4、免疫組化檢測HO-1、NOS2陽性細(xì)胞表達(dá)；低溫凍存標(biāo)本以RT-PCR方法檢測HO-1mRNA，Westernblotting檢測HO-1蛋白表達(dá)。除麻醉意外死亡3只外，對術(shù)后非預(yù)期死亡37只大鼠隨即進(jìn)行尸體解剖，以分析其死因。剩余DGER組14只模型動物于術(shù)后16周時又隨機(jī)分為HO-1誘導(dǎo)劑組、HO-1抑制劑組及生理鹽水對照組，隔日分別給予腹腔注射Hemin、ZnPP及生理鹽水，另選SO組動物作為空白對照。于干預(yù)處理第10次后次日處死

5、動物取材，所取組織標(biāo)本處理同上。統(tǒng)計學(xué)分析各組動物體重變化(術(shù)后4周內(nèi))、死亡率、食管病變發(fā)生率，食管及肺組織中HO-1mRNA和HO-1、NOS2活性表達(dá)情況等。 結(jié)果：①術(shù)前各試驗組平均體重與對照組相比無顯著性差異(P＞0.01)，術(shù)后1周各組動物體重均有增加，但各試驗組動物體重增加仍低于對照組(P＜0.05)，術(shù)后2周至4周各組大鼠飲食、活動基本恢復(fù)正常，GER組、DGER組平均體重增加與對照組無明顯差異(P＞0.05)，

6、而DER組大鼠平均體重增加仍顯著低于對照組(P＜0.01)。②除術(shù)前麻醉意外死亡3只外，術(shù)后非人為死亡動物共37只(30.8％)。摒除GER19只和DER13只后，模型組88只大鼠中術(shù)后死亡共26只(24.1％)，其中GER2組20只中僅1只(5％)，DER2組死亡7只(33.3％)，DGER組死亡18只(38.3％)，SO組大鼠20只未見死亡。通過尸解所見表明死因有胃擴(kuò)張、出血、胃穿孔、窒息、胸腔感染、腹腔感染等。③食管黏膜大體形態(tài)變

7、化：1個月時除GER2和DGER組各1只外，余模型大鼠均可見不同程度黏膜病變，表現(xiàn)為充血、散在點(diǎn)線狀紅斑及糜爛潰瘍。2個月各組模型均可見較明顯的食管黏膜病變，且隨時間延長各組食管黏膜改變逐漸加重，尤以DER組為著，食管下段糜爛、潰瘍擴(kuò)大并融合，并出現(xiàn)灰白色黏膜高度增生外觀(白斑)，范圍逐漸向上延伸，食管壁增厚，管腔不規(guī)則擴(kuò)張。以食管損傷程度相比：DER組＞DGER組＞GER組。DGER干預(yù)試驗中ZnPP組＞對照組＞Hemin組；各時間段

8、SO組動物食管黏膜外觀基本正常。④食管黏膜組織學(xué)改變：術(shù)后1個月時各試驗組動物均已發(fā)生不同程度的組織學(xué)改變，其中GER2組以輕中度炎癥為主，DER2組、DGER組均為中重度炎癥；2個月、3個月及4個月時各組均為中重度炎癥，且以淋巴細(xì)胞及少量嗜酸性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤的慢性炎癥為主，某些動物尚伴有急性炎細(xì)胞浸潤。食管上皮部分或全層缺損，底部覆以滲出物及肉芽組織，并可見食管上皮層不同程度增厚，以基底層及棘層細(xì)胞增生為主，乳頭延長，角化過度，

9、尤以DER2組為著。各組各時間段食管黏膜均未見柱狀上皮化生(Barrett食管)。各組組織學(xué)改變隨術(shù)后時間的延長而加重，由下向上逐漸減輕。對照組均未見明顯組織學(xué)改變。⑤肺組織病理學(xué)改變：光鏡下觀察可見模型組大鼠肺組織不同程度炎性改變，表現(xiàn)為支氣管黏膜、肺泡壁充血水腫，炎細(xì)胞浸潤，小血管擴(kuò)張。部分肺泡擴(kuò)張或纖維化。嚴(yán)重程度依次DER組＞DGER組＞GER組，且隨術(shù)后喂養(yǎng)時間延長而加重；干預(yù)試驗中ZnPP組＞NS組＞Hemin組。假手術(shù)組及

10、干預(yù)試驗中的空白對照組無明顯光鏡下異常表現(xiàn)。⑥食管及肺組織中HO-1mRNA、蛋白表達(dá)及免疫組化染色：在模型組食管中，HO-1mRNA、蛋白及免疫組化陽性細(xì)胞于術(shù)后1個月時表達(dá)均高于假手術(shù)組，其中GER組＜DGER組＜DER組，隨術(shù)后時間延長其表達(dá)呈降低趨勢；干預(yù)試驗中，與對照組相比ZnPP組減弱，而Hemin組增強(qiáng)。肺組織中HO-1mRNA、蛋白及免疫組化陽性細(xì)胞表達(dá)趨勢與食管組織一致。⑦食管及肺組織中NOS2表達(dá)：免疫組化染色、we

11、sternblotting試驗檢測結(jié)果表明，與SO組比較各模型組食管組織中NOS2表達(dá)增強(qiáng)，其中以DER組為著，DGER組次之，GER組最低，隨術(shù)后時間延長而逐漸增強(qiáng)。在干預(yù)試驗中，與對照組相比，ZnPP組增強(qiáng)，Hemin組減弱。肺組織NOS2蛋白及免疫組化陽性細(xì)胞染色的表達(dá)與食管組織中一致。⑧HO-1、NOS2在食管及肺組織中的表達(dá)定位：免疫組化顯示各組大鼠食管組織中陽性細(xì)胞表達(dá)主要位于黏膜下層，上皮層浸潤細(xì)胞也有少量表達(dá)；肺組織中在

12、肺泡及肺間質(zhì)細(xì)胞均可見表達(dá)。NOS2在食管組織上皮層、黏膜下層及肌層均可見表達(dá)，而在肺組織呈廣泛表達(dá)。 結(jié)論：采用食管胃底吻合術(shù)、十二指腸食管吻合、食管胃十二指腸吻合術(shù)3種保留全胃的術(shù)式可分別制備胃酸反流為主、十二指腸液反流為主和混合反流3種類型慢性GERD動物模型，食管病變形成率高，以膽汁反流為主者明顯，各組術(shù)后存活動物生存質(zhì)量高。但十二指腸食管吻合、食管胃十二指腸吻合術(shù)后大鼠死亡率較高，主要死因為感染、梗阻、出血、穿孔或吻合

13、口漏等。在3種慢性GERD大鼠模型除可形成食管損傷，肺部亦可見一定程度的組織學(xué)改變，為研究GERD并發(fā)呼吸系統(tǒng)并發(fā)癥提供了一定的組織學(xué)基礎(chǔ)。隨著食管和肺部損傷的發(fā)生，組織中HO-1及NOS2活性均被誘導(dǎo)表達(dá)，其程度與損傷程度一致，但隨術(shù)后病程進(jìn)展HO-1活性表達(dá)呈逐漸減弱趨勢，而NOS2表達(dá)仍進(jìn)行性增強(qiáng)，隨之病變程度也持續(xù)進(jìn)展。HO-1誘導(dǎo)劑干預(yù)通過增強(qiáng)HO-1表達(dá)，對NOS2表達(dá)有一定抑制作用，病變也隨之減輕；反之，HO-1抑制劑使H

14、O-1表達(dá)下調(diào)，NOS2表達(dá)增強(qiáng)，從而使病變進(jìn)一步惡化。試驗結(jié)果表明NOS2對GERD時食管和肺部病變發(fā)生發(fā)展可能具有一定促進(jìn)作用，而HO-1一方面通過限制NOS2合成，另一方面通過其下游產(chǎn)物(鐵蛋白、CO、膽紅素)對食管和肺部損傷的形成可能發(fā)揮著適應(yīng)性保護(hù)作用。GERD進(jìn)展過程中HO-1活性逐漸減弱，從而對NOS2活性抑制作用削弱，更會促進(jìn)組織損傷。但HO-1減弱機(jī)制尚待研究，可能是由于逐漸被誘導(dǎo)耗竭所致。通過適度促進(jìn)HO-1活性表達(dá)