人肝癌轉(zhuǎn)移相關(guān)分子的血清蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、本研究擬采用2-D DIGE聯(lián)合基質(zhì)輔助激光解吸離子化．串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF/TOF-MS)技術(shù)，對(duì)肝內(nèi)轉(zhuǎn)移和未轉(zhuǎn)移肝癌患者以及正常人血清進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究，篩選出轉(zhuǎn)移和未轉(zhuǎn)移肝癌患者血清中表達(dá)差異與轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白質(zhì)，并對(duì)差異蛋白進(jìn)行初步驗(yàn)證和功能解析，不僅有助于從分子水平闡述肝癌轉(zhuǎn)移的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，也可以為早期診斷肝癌轉(zhuǎn)移提供有效的預(yù)警牛物標(biāo)志物，并且有望為肝癌轉(zhuǎn)移的防治提供潛在的藥物靶點(diǎn)。目的: 1.建立和

2、優(yōu)化肝癌患者血清雙向熒光差異凝膠電泳體系(2-D DIGE)的技術(shù)平臺(tái)，為篩檢肝癌患者血清轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白奠定基礎(chǔ)。 2.運(yùn)用優(yōu)化后蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，建立肝癌轉(zhuǎn)移的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜(PMF)。 3.篩選和鑒定肝癌患者血清中轉(zhuǎn)移相關(guān)表達(dá)差異的蛋白質(zhì)，探討這些差異蛋白在肝癌轉(zhuǎn)移發(fā)生發(fā)展中的作用，補(bǔ)充肝癌轉(zhuǎn)移發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制。 4.對(duì)新發(fā)現(xiàn)有意義的轉(zhuǎn)移相關(guān)的差異蛋白進(jìn)行初步再驗(yàn)證，證實(shí)2-D DIGE分析和質(zhì)譜鑒定的真實(shí)

3、性、可靠性。 方法: 1.收集36例肝癌患者(肝內(nèi)轉(zhuǎn)移18例和未轉(zhuǎn)移18例)和12例正常人血清樣本。血清樣品經(jīng)不同濃度的乙腈部分變性，聯(lián)合去除高豐度蛋白進(jìn)行不同的方式預(yù)處理。 2.血清樣品經(jīng)過不同預(yù)處理后，分別進(jìn)行不同的CyDye染料交叉標(biāo)記，然后依次進(jìn)行2-D DIGE、圖像掃描，并用專用分析軟件DeCyder v6.0，比較各組樣本問蛋白點(diǎn)圖像差異和斑點(diǎn)檢出率，并評(píng)估該技術(shù)體系。 3.隨機(jī)抽取12例肝

4、內(nèi)轉(zhuǎn)移和12例未轉(zhuǎn)移肝癌患者及12例正常成人血清樣品，經(jīng)過確定優(yōu)化的預(yù)處理方式后，用不同的CyDye染料交叉標(biāo)記，依次進(jìn)行2一D DIGE以分離蛋白質(zhì)、圖像分析以尋找表達(dá)差異的蛋白點(diǎn)，對(duì)表達(dá)差異的蛋白點(diǎn)進(jìn)行MALDI-TOF/TOF-MS分析，獲得PMF，檢索MASCOT數(shù)據(jù)庫鑒定蛋白。 4.用經(jīng)典的分子牛物學(xué)技術(shù)Western Blot，對(duì)有意義的差異蛋白進(jìn)行再驗(yàn)證。 結(jié)論: 1.成功建立并優(yōu)化了血清蛋白質(zhì)組學(xué)

5、技術(shù)體系，證實(shí)了該技術(shù)平臺(tái)是篩選疾病相關(guān)血清標(biāo)志物的有力工具。 2.建立了肝癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜(PMF)，成功鑒定出30個(gè)差異性蛋白質(zhì)，共22種肝癌轉(zhuǎn)移相關(guān)血清蛋白質(zhì)，可能參與了肝癌轉(zhuǎn)移的過程。 3.初步確定并驗(yàn)證了CK9、CK10和C4A三個(gè)差異蛋白質(zhì)與肝癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可作為肝癌轉(zhuǎn)移相關(guān)潛在的血清標(biāo)志物，值得進(jìn)一步研究。 本課題的特色和創(chuàng)新點(diǎn)： 1.運(yùn)用高通量、高效率的比較蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)

6、手段，優(yōu)化了血清樣本的預(yù)處理，首次從肝內(nèi)轉(zhuǎn)移和未轉(zhuǎn)移肝癌患者以及正常人血清中篩選并鑒定出22種差異蛋白。 2.部分差異蛋白在肝癌的轉(zhuǎn)移中為首次報(bào)道，并且首次驗(yàn)證差異蛋白CK9,CK10,C4A在肝內(nèi)轉(zhuǎn)移患者血清中的變化，可能在肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。 本課題的潛在應(yīng)用價(jià)值： 1.篩檢出的部分差異蛋白可能成為肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的診斷的生物標(biāo)志物和預(yù)警判斷指標(biāo)，以豐富肝癌診療指標(biāo)的選擇和組合，并有助于制定和完善肝癌肝移