肝細胞癌肝內血管侵犯相關分子標記的血清蛋白質組學研究.pdf

1、肝細胞癌是全球發(fā)病率和死亡率均較高的惡性腫瘤之一,是世界排名第三的癌癥殺手,在我國則居第二位。診斷和治療技術的進步使得肝癌患者的生存率相比上個世紀有了較大提高,但術后高復發(fā)率和轉移率使肝癌患者的預后難以再上一個臺階,即使作肝移植,轉移復發(fā)仍然是肝癌面臨的首要問題。
　　肝癌的血管侵犯,通常指肉眼癌栓,表現(xiàn)為由癌細胞團塊和血栓組成的栓子堵塞門靜脈或肝靜脈主干,當肉眼癌栓形成后,幾乎喪失了手術根治的可能性,術后轉移和復發(fā)率高,嚴重影響

2、著患者的預后。如果能在癌栓形成的早期階段即微血管侵犯階段,或稱微癌栓,形成時就能發(fā)現(xiàn)并對其進行積極的干預,阻止其向肉眼癌栓發(fā)展,則能提高肝癌的術后生存率,降低復發(fā)和轉移,明顯改善其預后。但微癌栓只能通過手術切除后的標本進行病理學檢查而確定,無法在術前明確診斷,因此亟待能夠篩查肝癌微血管侵犯的蛋白標記物的出現(xiàn)。
　　蛋白質組學研究主要依賴三大技術,即蛋白質組的制備分離、蛋白質的鑒定和生物信息學技術。雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳(two-d

3、imensionalpolyacrylamidegelelectrophoresis,2D-PAGE)以及液相色譜(liquidchromatography,LC)是最主要的分離技術。質譜通過準確測量相對分子質量以及肽指紋譜來鑒定蛋白質和多肽,質譜在鑒定過程中則需要與數(shù)據庫、計算機網絡和應用軟件等相配合,應用生物信息學技術分析數(shù)量極其龐大的生物信息數(shù)據。蛋白質組學用于肝癌的研究主要包括發(fā)現(xiàn)新的腫瘤標記物、尋找新的治療靶點、闡明腫瘤發(fā)病機

4、制、提供腫瘤對治療的反應等信息以指導個體化治療等。
　　血清作為臨床上較易獲得的樣本包含著極為豐富的信息,能診斷多種疾病的發(fā)生和監(jiān)測機體的總體情況,其中所含的多種蛋白質常常用于臨床檢驗,因此選用血清樣本作為尋找肝癌微血管侵犯的標志物擁有極大潛力。然而血清蛋白質組學研究的困難在于其蛋白質組成高度復雜,蛋白質的濃度動態(tài)范圍超過10個數(shù)量級,具有標記物價值的蛋白質往往被高豐度蛋白質所掩蓋而不能被發(fā)掘。本實驗應用安捷倫公司的高豐度蛋白親和

5、色譜柱(AgilentHuman14MultipleAffinityRemovalSystemColumns,MARS)去除掉了血清中14種高豐度蛋白質有效地使這一困難得到一定程度的解決。
　　在與液相色譜分離技術配套的各種定量技術中,同位素標記的相對和絕對定量(isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation,iTRAQ)技術以其可同時比較多至8種樣品的優(yōu)勢獲得廣泛應用,該技術以報告離

6、子的豐度來表示蛋白質的相對含量,簡化了質譜數(shù)據的分析過程;其采用的多種同位素編碼的標簽標記多肽的氨基端或多肽鏈賴氨酸殘基上的氨基基團,標記效率高,提高了蛋白質組分析的覆蓋率和定量的準確性。
　　本課題采用iTRAQ定量技術聯(lián)合液相色譜串聯(lián)質譜(1iquidchromatography-tandemmassspectrometry,LC-MS/MS)技術,對無血管侵犯、微血管侵犯和肉眼血管侵犯的肝癌患者的血清樣本進行比較蛋白質組學研

7、究,尋找與肝癌血管侵犯相關的差異蛋白。鑒定得到75種蛋白質,其中三組樣本間的含量差異在20％以上的蛋白34種,由于其中所包含的7種蛋白屬于MARS針對的高豐度蛋白,而且在免疫吸附的過程中清除的不徹底可能會使得定量結果發(fā)生偏倚,因此我們將另外27種蛋白質認定為差異蛋白。根據生物信息學分析結果了解到這些差異蛋白主要在抗原遞呈、細胞運動、碳水化合物代謝、細胞間信號轉導和相互作用以及脂質代謝中發(fā)揮重要作用。微血管侵犯組與無血管侵犯組相比,12種

8、蛋白表達上調,8種蛋白表達下調;肉眼血管侵犯組與無血管侵犯組相比,8種蛋白表達上調,6種蛋白表達下調。
　　根據一定標準選取了5種蛋白進行Westemblot驗證,其中血清對氧磷酶1(PON1)的表達情況與iTRAQ結果高度一致,是極有潛力的標記蛋白。用免疫組織化學技術檢驗了PON1在肝癌組織及癌旁組織的表達情況,發(fā)現(xiàn)三組患者肝癌組織中PON1的表達差異與血清一致,癌旁組織表達無統(tǒng)計學差異,且癌旁組織表達高于相應的癌組織。本實驗研

9、究表明,PON1作為血清中的一種抗氧化蛋白,可能對腫瘤細胞的轉移有重要影響,有希望作為早期診斷肝癌微血管侵犯的血清蛋白質標記物。
　　潛在應用價值
　　應用iTRAQ聯(lián)合LC-MS/MS技術,是較新的蛋白質組學研究策略之一,并且被證明行之有效,本研究篩查出的一種血清抗氧化蛋白——血清對氧磷酶(PON1)與肝癌血管侵犯具有顯著相關性，是潛在的診斷肝癌血管侵犯的標記物和治療新靶點。
　　創(chuàng)新點
　　本課題首次將肝癌的

10、微血管侵犯的概念從傳統(tǒng)的肝癌門靜脈癌栓的概念中細分出來加以針對性研究,有利于尋找到能診斷肝癌血管侵犯早期階段的生物標記物;利用親和色譜柱去除了血清中的高豐度蛋白質,有效提高了血清中具有潛在標記物價值的蛋白的檢出率;利用iTRAQ聯(lián)合LC-MS/MS技術,克服了以往傳統(tǒng)技術上的一些弱點。本研究篩查出一系列與肝癌血管侵犯存在相關性的差異蛋白分子,其中血清對氧磷酶(PON1)與肝癌血管侵犯的相關性得到進一步證明,為探索可用于臨床上診斷肝癌血管