肝細(xì)胞癌肝內(nèi)血管侵犯相關(guān)分子標(biāo)記的血清蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、肝細(xì)胞癌是全球發(fā)病率和死亡率均較高的惡性腫瘤之一,是世界排名第三的癌癥殺手,在我國(guó)則居第二位。診斷和治療技術(shù)的進(jìn)步使得肝癌患者的生存率相比上個(gè)世紀(jì)有了較大提高,但術(shù)后高復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率使肝癌患者的預(yù)后難以再上一個(gè)臺(tái)階,即使作肝移植,轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)仍然是肝癌面臨的首要問題。
　　肝癌的血管侵犯,通常指肉眼癌栓,表現(xiàn)為由癌細(xì)胞團(tuán)塊和血栓組成的栓子堵塞門靜脈或肝靜脈主干,當(dāng)肉眼癌栓形成后,幾乎喪失了手術(shù)根治的可能性,術(shù)后轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)率高,嚴(yán)重影響

2、著患者的預(yù)后。如果能在癌栓形成的早期階段即微血管侵犯階段,或稱微癌栓,形成時(shí)就能發(fā)現(xiàn)并對(duì)其進(jìn)行積極的干預(yù),阻止其向肉眼癌栓發(fā)展,則能提高肝癌的術(shù)后生存率,降低復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,明顯改善其預(yù)后。但微癌栓只能通過手術(shù)切除后的標(biāo)本進(jìn)行病理學(xué)檢查而確定,無法在術(shù)前明確診斷,因此亟待能夠篩查肝癌微血管侵犯的蛋白標(biāo)記物的出現(xiàn)。
　　蛋白質(zhì)組學(xué)研究主要依賴三大技術(shù),即蛋白質(zhì)組的制備分離、蛋白質(zhì)的鑒定和生物信息學(xué)技術(shù)。雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳(two-d

3、imensionalpolyacrylamidegelelectrophoresis,2D-PAGE)以及液相色譜(liquidchromatography,LC)是最主要的分離技術(shù)。質(zhì)譜通過準(zhǔn)確測(cè)量相對(duì)分子質(zhì)量以及肽指紋譜來鑒定蛋白質(zhì)和多肽,質(zhì)譜在鑒定過程中則需要與數(shù)據(jù)庫(kù)、計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)和應(yīng)用軟件等相配合,應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)分析數(shù)量極其龐大的生物信息數(shù)據(jù)。蛋白質(zhì)組學(xué)用于肝癌的研究主要包括發(fā)現(xiàn)新的腫瘤標(biāo)記物、尋找新的治療靶點(diǎn)、闡明腫瘤發(fā)病機(jī)

4、制、提供腫瘤對(duì)治療的反應(yīng)等信息以指導(dǎo)個(gè)體化治療等。
　　血清作為臨床上較易獲得的樣本包含著極為豐富的信息,能診斷多種疾病的發(fā)生和監(jiān)測(cè)機(jī)體的總體情況,其中所含的多種蛋白質(zhì)常常用于臨床檢驗(yàn),因此選用血清樣本作為尋找肝癌微血管侵犯的標(biāo)志物擁有極大潛力。然而血清蛋白質(zhì)組學(xué)研究的困難在于其蛋白質(zhì)組成高度復(fù)雜,蛋白質(zhì)的濃度動(dòng)態(tài)范圍超過10個(gè)數(shù)量級(jí),具有標(biāo)記物價(jià)值的蛋白質(zhì)往往被高豐度蛋白質(zhì)所掩蓋而不能被發(fā)掘。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用安捷倫公司的高豐度蛋白親和

5、色譜柱(AgilentHuman14MultipleAffinityRemovalSystemColumns,MARS)去除掉了血清中14種高豐度蛋白質(zhì)有效地使這一困難得到一定程度的解決。
　　在與液相色譜分離技術(shù)配套的各種定量技術(shù)中,同位素標(biāo)記的相對(duì)和絕對(duì)定量(isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation,iTRAQ)技術(shù)以其可同時(shí)比較多至8種樣品的優(yōu)勢(shì)獲得廣泛應(yīng)用,該技術(shù)以報(bào)告離

6、子的豐度來表示蛋白質(zhì)的相對(duì)含量,簡(jiǎn)化了質(zhì)譜數(shù)據(jù)的分析過程;其采用的多種同位素編碼的標(biāo)簽標(biāo)記多肽的氨基端或多肽鏈賴氨酸殘基上的氨基基團(tuán),標(biāo)記效率高,提高了蛋白質(zhì)組分析的覆蓋率和定量的準(zhǔn)確性。
　　本課題采用iTRAQ定量技術(shù)聯(lián)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(1iquidchromatography-tandemmassspectrometry,LC-MS/MS)技術(shù),對(duì)無血管侵犯、微血管侵犯和肉眼血管侵犯的肝癌患者的血清樣本進(jìn)行比較蛋白質(zhì)組學(xué)研

7、究,尋找與肝癌血管侵犯相關(guān)的差異蛋白。鑒定得到75種蛋白質(zhì),其中三組樣本間的含量差異在20％以上的蛋白34種,由于其中所包含的7種蛋白屬于MARS針對(duì)的高豐度蛋白,而且在免疫吸附的過程中清除的不徹底可能會(huì)使得定量結(jié)果發(fā)生偏倚,因此我們將另外27種蛋白質(zhì)認(rèn)定為差異蛋白。根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果了解到這些差異蛋白主要在抗原遞呈、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、碳水化合物代謝、細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和相互作用以及脂質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用。微血管侵犯組與無血管侵犯組相比,12種

8、蛋白表達(dá)上調(diào),8種蛋白表達(dá)下調(diào);肉眼血管侵犯組與無血管侵犯組相比,8種蛋白表達(dá)上調(diào),6種蛋白表達(dá)下調(diào)。
　　根據(jù)一定標(biāo)準(zhǔn)選取了5種蛋白進(jìn)行Westemblot驗(yàn)證,其中血清對(duì)氧磷酶1(PON1)的表達(dá)情況與iTRAQ結(jié)果高度一致,是極有潛力的標(biāo)記蛋白。用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢驗(yàn)了PON1在肝癌組織及癌旁組織的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)三組患者肝癌組織中PON1的表達(dá)差異與血清一致,癌旁組織表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,且癌旁組織表達(dá)高于相應(yīng)的癌組織。本實(shí)驗(yàn)研

9、究表明,PON1作為血清中的一種抗氧化蛋白,可能對(duì)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移有重要影響,有希望作為早期診斷肝癌微血管侵犯的血清蛋白質(zhì)標(biāo)記物。
　　潛在應(yīng)用價(jià)值
　　應(yīng)用iTRAQ聯(lián)合LC-MS/MS技術(shù),是較新的蛋白質(zhì)組學(xué)研究策略之一,并且被證明行之有效,本研究篩查出的一種血清抗氧化蛋白——血清對(duì)氧磷酶(PON1)與肝癌血管侵犯具有顯著相關(guān)性，是潛在的診斷肝癌血管侵犯的標(biāo)記物和治療新靶點(diǎn)。
　　創(chuàng)新點(diǎn)
　　本課題首次將肝癌的

10、微血管侵犯的概念從傳統(tǒng)的肝癌門靜脈癌栓的概念中細(xì)分出來加以針對(duì)性研究,有利于尋找到能診斷肝癌血管侵犯早期階段的生物標(biāo)記物;利用親和色譜柱去除了血清中的高豐度蛋白質(zhì),有效提高了血清中具有潛在標(biāo)記物價(jià)值的蛋白的檢出率;利用iTRAQ聯(lián)合LC-MS/MS技術(shù),克服了以往傳統(tǒng)技術(shù)上的一些弱點(diǎn)。本研究篩查出一系列與肝癌血管侵犯存在相關(guān)性的差異蛋白分子,其中血清對(duì)氧磷酶(PON1)與肝癌血管侵犯的相關(guān)性得到進(jìn)一步證明,為探索可用于臨床上診斷肝癌血管