快速老化模型小鼠血清蛋白質(zhì)組初步研究.pdf

1、為從血清中尋找增齡過程中與SAMP8病理特征發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)的病理性蛋白質(zhì)，作為反映衰老或功能低下的標(biāo)志性分子，并進(jìn)一步探索其作為藥物作用分子靶標(biāo)的可能性，同時(shí)也為研究SAM的快速老化機(jī)理提供新的切入點(diǎn)，本研究首先探索了血清蛋白質(zhì)組學(xué)研究的有關(guān)技術(shù)方法，進(jìn)而應(yīng)用血清比較蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，研究、比較了增齡過程中SAMR1和SAMP8血清蛋白表達(dá)的變化，并對(duì)典型的差異蛋白進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定。 一、SAM血清比較蛋白質(zhì)組學(xué)的研究1.不同

2、月齡SAMP8和SAMR1血清的差異蛋白分別選用2、6和12月齡雌性SAM，取外周血并制備血清，采用Brad-ford法測(cè)定蛋白濃度，然后應(yīng)用固相pH3-10梯度雙向凝膠電泳，分離2、6、12月齡SAMP8和SAMR1血清總蛋白，制備蛋白表達(dá)譜，銀染顯色，ImageMaster2DElite4.01比較分析2D圖譜，確定差異蛋白。蛋白電泳圖譜顯示，SAMP8和SAMR1差異表達(dá)的血清蛋白主要分布在以下5個(gè)區(qū)域：在分子量約2.5-3.5k

3、Da、等電點(diǎn)約為4.0-5.0之間的區(qū)域1中，至少有5個(gè)蛋白出現(xiàn)在2、6、12月齡SAMP8血清中，而在相同月齡的SAMR1血清中未發(fā)現(xiàn)這5個(gè)蛋白。 結(jié)果表明，在不同月齡SAMR1和SAMP8的血清中均存在大量差異蛋白，在這些差異蛋白中，有些是量的差別，有的則是有和無的差別?？梢哉J(rèn)為，這些差異蛋白可能與SAMP8的老化癥狀和某些病理生理特征具有密切關(guān)系，是衰老和病理改變發(fā)生與發(fā)展過程中的重要表現(xiàn)。 2.SAMR1和SAMP

4、8血清差異蛋白的增齡性變化本研究重點(diǎn)觀察了2、6、12和15月齡SAMP8和SAMR1血清差異蛋白點(diǎn)1-7的變化規(guī)律。結(jié)果顯示，點(diǎn)1-5只出現(xiàn)在15月齡SAMR1血清中，而在2、6和12月齡時(shí)血清未檢測(cè)到這5個(gè)點(diǎn)；與之不同，點(diǎn)1-5在不同月齡SAMP8的血清中則穩(wěn)定表達(dá)，由于點(diǎn)1-5只出現(xiàn)在15月齡SAMR1的血清中，而在2-15月齡SAMP8的血清中都有表達(dá)，表明這5個(gè)點(diǎn)只在機(jī)體處于特定的老化程度時(shí)出現(xiàn)，提示其與機(jī)體衰老程度具有密切關(guān)

5、系。點(diǎn)6和7在不同月齡SAMR1血清中穩(wěn)定表達(dá)，表達(dá)水平無明顯的變化，在2、6、12月齡SAMP8血清中，其表達(dá)有隨增齡增加的趨勢(shì)，至15月齡時(shí)這兩個(gè)點(diǎn)分別分化成兩個(gè)點(diǎn)。 3.血清差異蛋白的質(zhì)譜鑒定上述7個(gè)點(diǎn)分別經(jīng)雙向電泳分離、考馬斯亮藍(lán)染色、膠內(nèi)酶切、MALDI-TOF測(cè)定肽質(zhì)量指紋圖譜、Q-TOF測(cè)定選定的肽序列和數(shù)據(jù)庫檢索，對(duì)其歸屬進(jìn)行了鑒定。結(jié)果表明，點(diǎn)3為免疫球蛋白κ鏈的V區(qū)片斷，即M-T413，分子量約為1.22kD

6、a，等電點(diǎn)約為5.18，是一個(gè)CD4的單克隆抗體。已有研究表明，M-T413與CD4的V1區(qū)結(jié)合，可阻止HIV感染，對(duì)自身免疫病也具有一定治療作用。點(diǎn)4為Fab片段A鏈32C2A，分子量約為2.38kDa，等電點(diǎn)約為6.23，對(duì)細(xì)胞色素P450芳香化酶的活性具有抑制作用。細(xì)胞色素P450芳香化酶可以催化雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素，32C2A對(duì)它的抑制可能導(dǎo)致SAMP8體內(nèi)雌激素減少，加速其衰老進(jìn)程。點(diǎn)6為阿樸脂蛋白A-Ⅱ(Apolipoprot

7、einA-Ⅱ，ApoA2)，分子量約為1.13kDa，等電點(diǎn)約為6.57。ApoA2由三個(gè)等位基因分別編碼三種蛋白異構(gòu)體(AApoA2，BApoA2andCApoA2)，三者之間僅在四個(gè)位置上的氨基酸不同，在不同品系小鼠中分布亦不同，與老化淀粉樣病變的易感性有關(guān)：老化淀粉樣病變嚴(yán)重且發(fā)病率高的SAMP1、SAMP2、SAMP7、SAMP9、SAMP10、SAMP11、SJL/J、LLC等品系分布CApoA2，它的第5位氨基酸為谷氨酸；B

8、ApoA2多存在于淀粉樣病變發(fā)生率較低的SAMR1、SAMR4、SAMP6、BALB/C、NZB等品系中，其第5位氨基酸為脯氨酸；而26位氨基酸是蛋氨酸的AApoA2則多存在于顯示中等程度淀粉樣沉積的SAMP8、AKR/J、B10BR、C57BL/6J和NSY品系中。但本研究未能鑒定阿樸脂蛋白A-Ⅱ的亞型。點(diǎn)5為甲胎蛋白，分子量約為4.72kDa，等電點(diǎn)約為5.47，它是哺乳動(dòng)物和人在胚胎期由胚胎肝細(xì)胞和卵黃囊等合成的血清α-球蛋白，在

9、成人血清中含量極微，而癌癥時(shí)其合成和分泌均增加，在臨床上主要用于肝細(xì)胞肝癌的診斷與鑒別診斷，但其在SAMP8老化過程中的生物學(xué)意義有待研究。點(diǎn)1、2、7在數(shù)據(jù)庫中沒有檢索到匹配的蛋白，可能是新蛋白。 此外，由血清總蛋白質(zhì)的雙向電泳銀染圖譜可見，SAMP8同SAMR1在區(qū)域3、4譜形具有很大差異。根據(jù)數(shù)據(jù)庫資料，免疫球蛋白重鏈多位于區(qū)域3、免疫球蛋白輕鏈多位于區(qū)域4，這些免疫球蛋白具有多種生理功能，除對(duì)免疫系統(tǒng)本身的功能具有重要作

10、用之外，還影響機(jī)體神經(jīng)和內(nèi)分泌等系統(tǒng)的功能，如32C2A可以影響雌激素的產(chǎn)生，從而對(duì)神經(jīng)元的功能產(chǎn)生影響。兩個(gè)亞系血清蛋白在這兩個(gè)區(qū)域的顯著差異提示這些免疫球蛋白種類與量的改變可能與快速老化或某些病理變化具有密切關(guān)系。 二、SAMP8脾細(xì)胞M-T413mRNA表達(dá)的變化經(jīng)質(zhì)譜鑒定，SAMP8血清中含量明顯增高的蛋白M-T413為免疫球蛋白κ鏈V區(qū)的一個(gè)內(nèi)源性CD4單克隆抗體，因此，它可能主要來源于免疫系統(tǒng)。為了解M-T413在免

11、疫細(xì)胞中的表達(dá)情況，我們進(jìn)一步應(yīng)用RT-PCR技術(shù)研究了其mRNA在SAMP8脾細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果表明，SAMR1和SAMP8在增齡過程中脾細(xì)胞M-T413mRNA表達(dá)水平都發(fā)生了明顯改變。SAMR1在2月齡時(shí)脾細(xì)胞M-T413的mRNA的表達(dá)水平最低，隨后逐漸增高，6月齡時(shí)達(dá)高峰，而后逐漸降低，但在15月齡時(shí)其表達(dá)水平仍明顯高于2月齡時(shí)的表達(dá)水平。雖然6月齡時(shí)SAMR1脾細(xì)胞M-T413mRNA的表達(dá)水平最高，但在其血清中卻未檢測(cè)到M

12、-T413蛋白。 與SAMR1不同，SAMP8在2月齡時(shí)脾細(xì)胞M-T413mRNA的表達(dá)水平最高，而后逐步下降，至12月齡時(shí)基本下降至最低，與15月齡無明顯差異。與SAMR1相比，2月齡SAMP8脾細(xì)胞M-T413mRNA的表達(dá)水平明顯高于同月齡SAMR1，與2月齡SAMP8血清M-T413蛋白水平明顯增高的現(xiàn)象相一致。但在6、12和15月齡時(shí)，SAMR1和SAMP8脾細(xì)胞M-T413mRNA的表達(dá)水平無明顯差異。 根據(jù)

13、以上結(jié)果可以認(rèn)為，脾細(xì)胞是血清M-T413的重要來源之一。SAMR1和SAMP8在增齡過程中脾細(xì)胞M-T413mRNA的表達(dá)水平都發(fā)生了相應(yīng)的變化，SAMR1的表達(dá)水平在2月齡時(shí)最低，然后逐步增高，至6月齡時(shí)又逐漸下降，而SAMP8則是在2月齡時(shí)表達(dá)水平最高，然后逐步下降。2月齡時(shí)SAMP8脾細(xì)胞M-T413mRNA的表達(dá)水平明顯高于同齡SAMR1。 三、SAMP8外周血CD4+細(xì)胞數(shù)的增齡性變化M-T413是內(nèi)源性CD4的單克

14、隆抗體，可能對(duì)外周血CD4+細(xì)胞的數(shù)量產(chǎn)生影響。因此我們進(jìn)一步觀察了增齡過程中SAM外周血CD4+細(xì)胞數(shù)目的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果表明，SAMR1和SAMP8外周血CD4+細(xì)胞數(shù)目均隨增齡而降低，其中SAMR1在2月齡和6月齡時(shí)均處于較高水平，而后逐步下降，12和15月齡時(shí)CD4+細(xì)胞的數(shù)目明顯低于2月齡和6月齡；SAMP8則在2月齡時(shí)處于最高水平，隨后逐步降低，至12和15月齡時(shí)降低幅度顯著。此外，2、6、12和15月齡SAMP8外周血CD4

15、+細(xì)胞的數(shù)目均明顯低于同月齡SAMR1。 以上結(jié)果表明，SAMR1和SAMP8外周血CD4+細(xì)胞的數(shù)目均隨增齡而逐步降低，結(jié)合血清M-T413水平的增齡性變化規(guī)律進(jìn)行分析可以看出，SAMR1在6月齡時(shí)外周血CD4+細(xì)胞數(shù)目最高，隨后逐步下降，此時(shí)其血清中尚未檢測(cè)到M-T413，盡管脾細(xì)胞M-T413mRNA此時(shí)的表達(dá)水平最高；而SAMP8自2月齡起血清持續(xù)存在M-T413，脾細(xì)胞M-T413mRNA表達(dá)水平在2月齡時(shí)最高，其外周