快速老化模型小鼠血清蛋白質組初步研究.pdf

1、為從血清中尋找增齡過程中與SAMP8病理特征發(fā)生與發(fā)展密切相關的病理性蛋白質，作為反映衰老或功能低下的標志性分子，并進一步探索其作為藥物作用分子靶標的可能性，同時也為研究SAM的快速老化機理提供新的切入點，本研究首先探索了血清蛋白質組學研究的有關技術方法，進而應用血清比較蛋白質組學的方法，研究、比較了增齡過程中SAMR1和SAMP8血清蛋白表達的變化，并對典型的差異蛋白進行了結構鑒定。 一、SAM血清比較蛋白質組學的研究1.不同

2、月齡SAMP8和SAMR1血清的差異蛋白分別選用2、6和12月齡雌性SAM，取外周血并制備血清，采用Brad-ford法測定蛋白濃度，然后應用固相pH3-10梯度雙向凝膠電泳，分離2、6、12月齡SAMP8和SAMR1血清總蛋白，制備蛋白表達譜，銀染顯色，ImageMaster2DElite4.01比較分析2D圖譜，確定差異蛋白。蛋白電泳圖譜顯示，SAMP8和SAMR1差異表達的血清蛋白主要分布在以下5個區(qū)域：在分子量約2.5-3.5k

3、Da、等電點約為4.0-5.0之間的區(qū)域1中，至少有5個蛋白出現(xiàn)在2、6、12月齡SAMP8血清中，而在相同月齡的SAMR1血清中未發(fā)現(xiàn)這5個蛋白。 結果表明，在不同月齡SAMR1和SAMP8的血清中均存在大量差異蛋白，在這些差異蛋白中，有些是量的差別，有的則是有和無的差別。可以認為，這些差異蛋白可能與SAMP8的老化癥狀和某些病理生理特征具有密切關系，是衰老和病理改變發(fā)生與發(fā)展過程中的重要表現(xiàn)。 2.SAMR1和SAMP

4、8血清差異蛋白的增齡性變化本研究重點觀察了2、6、12和15月齡SAMP8和SAMR1血清差異蛋白點1-7的變化規(guī)律。結果顯示，點1-5只出現(xiàn)在15月齡SAMR1血清中，而在2、6和12月齡時血清未檢測到這5個點；與之不同，點1-5在不同月齡SAMP8的血清中則穩(wěn)定表達，由于點1-5只出現(xiàn)在15月齡SAMR1的血清中，而在2-15月齡SAMP8的血清中都有表達，表明這5個點只在機體處于特定的老化程度時出現(xiàn)，提示其與機體衰老程度具有密切關

5、系。點6和7在不同月齡SAMR1血清中穩(wěn)定表達，表達水平無明顯的變化，在2、6、12月齡SAMP8血清中，其表達有隨增齡增加的趨勢，至15月齡時這兩個點分別分化成兩個點。 3.血清差異蛋白的質譜鑒定上述7個點分別經雙向電泳分離、考馬斯亮藍染色、膠內酶切、MALDI-TOF測定肽質量指紋圖譜、Q-TOF測定選定的肽序列和數據庫檢索，對其歸屬進行了鑒定。結果表明，點3為免疫球蛋白κ鏈的V區(qū)片斷，即M-T413，分子量約為1.22kD

6、a，等電點約為5.18，是一個CD4的單克隆抗體。已有研究表明，M-T413與CD4的V1區(qū)結合，可阻止HIV感染，對自身免疫病也具有一定治療作用。點4為Fab片段A鏈32C2A，分子量約為2.38kDa，等電點約為6.23，對細胞色素P450芳香化酶的活性具有抑制作用。細胞色素P450芳香化酶可以催化雄激素轉化為雌激素，32C2A對它的抑制可能導致SAMP8體內雌激素減少，加速其衰老進程。點6為阿樸脂蛋白A-Ⅱ(Apolipoprot

7、einA-Ⅱ，ApoA2)，分子量約為1.13kDa，等電點約為6.57。ApoA2由三個等位基因分別編碼三種蛋白異構體(AApoA2，BApoA2andCApoA2)，三者之間僅在四個位置上的氨基酸不同，在不同品系小鼠中分布亦不同，與老化淀粉樣病變的易感性有關：老化淀粉樣病變嚴重且發(fā)病率高的SAMP1、SAMP2、SAMP7、SAMP9、SAMP10、SAMP11、SJL/J、LLC等品系分布CApoA2，它的第5位氨基酸為谷氨酸；B

8、ApoA2多存在于淀粉樣病變發(fā)生率較低的SAMR1、SAMR4、SAMP6、BALB/C、NZB等品系中，其第5位氨基酸為脯氨酸；而26位氨基酸是蛋氨酸的AApoA2則多存在于顯示中等程度淀粉樣沉積的SAMP8、AKR/J、B10BR、C57BL/6J和NSY品系中。但本研究未能鑒定阿樸脂蛋白A-Ⅱ的亞型。點5為甲胎蛋白，分子量約為4.72kDa，等電點約為5.47，它是哺乳動物和人在胚胎期由胚胎肝細胞和卵黃囊等合成的血清α-球蛋白，在

9、成人血清中含量極微，而癌癥時其合成和分泌均增加，在臨床上主要用于肝細胞肝癌的診斷與鑒別診斷，但其在SAMP8老化過程中的生物學意義有待研究。點1、2、7在數據庫中沒有檢索到匹配的蛋白，可能是新蛋白。 此外，由血清總蛋白質的雙向電泳銀染圖譜可見，SAMP8同SAMR1在區(qū)域3、4譜形具有很大差異。根據數據庫資料，免疫球蛋白重鏈多位于區(qū)域3、免疫球蛋白輕鏈多位于區(qū)域4，這些免疫球蛋白具有多種生理功能，除對免疫系統(tǒng)本身的功能具有重要作

10、用之外，還影響機體神經和內分泌等系統(tǒng)的功能，如32C2A可以影響雌激素的產生，從而對神經元的功能產生影響。兩個亞系血清蛋白在這兩個區(qū)域的顯著差異提示這些免疫球蛋白種類與量的改變可能與快速老化或某些病理變化具有密切關系。 二、SAMP8脾細胞M-T413mRNA表達的變化經質譜鑒定，SAMP8血清中含量明顯增高的蛋白M-T413為免疫球蛋白κ鏈V區(qū)的一個內源性CD4單克隆抗體，因此，它可能主要來源于免疫系統(tǒng)。為了解M-T413在免

11、疫細胞中的表達情況，我們進一步應用RT-PCR技術研究了其mRNA在SAMP8脾細胞中的表達。結果表明，SAMR1和SAMP8在增齡過程中脾細胞M-T413mRNA表達水平都發(fā)生了明顯改變。SAMR1在2月齡時脾細胞M-T413的mRNA的表達水平最低，隨后逐漸增高，6月齡時達高峰，而后逐漸降低，但在15月齡時其表達水平仍明顯高于2月齡時的表達水平。雖然6月齡時SAMR1脾細胞M-T413mRNA的表達水平最高，但在其血清中卻未檢測到M

12、-T413蛋白。 與SAMR1不同，SAMP8在2月齡時脾細胞M-T413mRNA的表達水平最高，而后逐步下降，至12月齡時基本下降至最低，與15月齡無明顯差異。與SAMR1相比，2月齡SAMP8脾細胞M-T413mRNA的表達水平明顯高于同月齡SAMR1，與2月齡SAMP8血清M-T413蛋白水平明顯增高的現(xiàn)象相一致。但在6、12和15月齡時，SAMR1和SAMP8脾細胞M-T413mRNA的表達水平無明顯差異。 根據

13、以上結果可以認為，脾細胞是血清M-T413的重要來源之一。SAMR1和SAMP8在增齡過程中脾細胞M-T413mRNA的表達水平都發(fā)生了相應的變化，SAMR1的表達水平在2月齡時最低，然后逐步增高，至6月齡時又逐漸下降，而SAMP8則是在2月齡時表達水平最高，然后逐步下降。2月齡時SAMP8脾細胞M-T413mRNA的表達水平明顯高于同齡SAMR1。 三、SAMP8外周血CD4+細胞數的增齡性變化M-T413是內源性CD4的單克

14、隆抗體，可能對外周血CD4+細胞的數量產生影響。因此我們進一步觀察了增齡過程中SAM外周血CD4+細胞數目的動態(tài)變化。結果表明，SAMR1和SAMP8外周血CD4+細胞數目均隨增齡而降低，其中SAMR1在2月齡和6月齡時均處于較高水平，而后逐步下降，12和15月齡時CD4+細胞的數目明顯低于2月齡和6月齡；SAMP8則在2月齡時處于最高水平，隨后逐步降低，至12和15月齡時降低幅度顯著。此外，2、6、12和15月齡SAMP8外周血CD4

15、+細胞的數目均明顯低于同月齡SAMR1。 以上結果表明，SAMR1和SAMP8外周血CD4+細胞的數目均隨增齡而逐步降低，結合血清M-T413水平的增齡性變化規(guī)律進行分析可以看出，SAMR1在6月齡時外周血CD4+細胞數目最高，隨后逐步下降，此時其血清中尚未檢測到M-T413，盡管脾細胞M-T413mRNA此時的表達水平最高；而SAMP8自2月齡起血清持續(xù)存在M-T413，脾細胞M-T413mRNA表達水平在2月齡時最高，其外周