脫細胞腦組織修復支架的研制及其生物相容性研究.pdf

1、目的： 研制交聯(lián)型天然脫細胞腦組織修復支架，并分析、評估其形態(tài)結(jié)構(gòu)、主要成分、生物相容性，為研制出理想的腦損傷修復支架提供初步的實驗依據(jù)。 方法：1.脫細胞腦組織修復支架制備：(1)13月齡健康Sprague—Dawley(SD)成年大鼠10只，雌雄不限，體重為180±20g。消毒、麻醉后取出大鼠大腦，分離出腦皮質(zhì)后，運用凍融、低滲、Triton X-100、脫氧膽酸鈉、DNA/RNA酶及Genipin交聯(lián)等方法處理，初步制成交

2、聯(lián)型脫細胞腦組織修復支架。(2)支架材料的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察：解剖顯微鏡下觀察脫細胞腦組織修復支架制備過程中形態(tài)變化；并分別通過光學顯微鏡和掃描電鏡觀察支架材料內(nèi)部結(jié)構(gòu)特征和三維立體構(gòu)型。(3)細胞外基質(zhì)成分分析：通過免疫組化的兩種方法對比正常腦組織和脫細胞腦組織修復支架中三種主要的細胞外基質(zhì)FN、LN和ColⅣ的含量和分布情況。2.脫細胞腦組織修復支架的生物相容性研究：(1)組織相容性：3月齡健康Sprague—Dawley(SD)成年大鼠

3、52只，雌性，體重為180±20g。隨機將動物分為假手術(shù)組(陰性對照，4只)、新鮮腦組織組(陽性對照，12只)、明膠海綿組(12只)、脫細胞支架組(12只)、交聯(lián)型天然脫細胞腦組織修復支架組(12只)；將樣本植入SD大鼠背部肌肉，于試驗后1周、2周、4周、12周處死動物，切取樣品及其周圍0.5～1 cm肌肉組織。對標本進行HE染色觀察炎癥反應及炎癥細胞浸潤程度。(2)細胞相容性：神經(jīng)干細胞單層培養(yǎng)；取出生1天內(nèi)SD大鼠6只，雌雄不限，取

4、出神經(jīng)干細胞，在Gage和Ray方法的基礎上，改良單層培養(yǎng)細胞；倒置相差顯微鏡每天觀察細胞生長變化，并通過免疫熒光染色方法鑒定細胞類型及增殖情況。(3)細胞相容性檢測：將支架和神經(jīng)干細胞、神經(jīng)細胞、SD大鼠肺成纖維細胞共培養(yǎng)1周觀察支架的毒性反應；用支架浸提液(1：1和1：2)培養(yǎng)神經(jīng)干細胞1周，通過MTT方法觀察細胞生長增殖情況，以神經(jīng)干單層培養(yǎng)基(DMEM/F12+N2+bFGF)培養(yǎng)神經(jīng)干細胞作為陽性對照，DMSO做空白對照；將神

5、經(jīng)干細胞種植于交聯(lián)型脫細胞腦組織支架，1周后通過光鏡和電鏡觀察細胞在支架上的生長增殖以及與支架材料的粘附情況。 結(jié)果： 1.脫細胞腦組織修復支架制備。(1)支架的形態(tài)結(jié)構(gòu)：成年SD大鼠新鮮腦組織經(jīng)脫細胞處理后，細胞成分已去除，形態(tài)上具有高度仿生的三維立體空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，親水性良好。經(jīng)Genipin交聯(lián)后支架材料空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)變得更為明顯，無菌保留3個月未見明顯降解，未見明顯細胞碎屑殘留。孔洞形態(tài)相似，孔徑大小相近，平均孔徑1

6、4.85±2.51μm，孔隙率達90.44％±2.16％。(2)細胞外基質(zhì)成分免疫組化分析：正常腦組織中細胞外基質(zhì)成分LN有強陽性表達，F(xiàn)N有陽性表達，而ColⅣ為弱陽性表達，主要分布于腦內(nèi)血管的基底膜上。經(jīng)過脫細胞處理后的修復支架材料LN仍有強陽性表達、FN和ColⅣ均為弱陽性表達。 2.脫細胞腦組織修復支架的生物相容性研究。(1)組織相容性(肌肉植入試驗)：所有大鼠均順利成活，無死亡，麻醉清醒后即可自由活動。飲食正常，大小便

7、正常。假手術(shù)組在術(shù)后1周僅見少量淋巴細胞，1周后未見炎癥細胞。新鮮腦組織組術(shù)后第3天，1周、4周、12周試樣周圍均可見以嗜中性粒細胞浸潤為主的炎癥反應，可見大量毛細血管和小血管生成。未交聯(lián)腦組織支架組在術(shù)后3天可見少量中性粒細胞，并可見少量毛細血管生成。術(shù)后1周、4周可見少量淋巴細胞，毛細血管未見明顯增多；12周僅見少量淋巴細胞。明膠海綿組和交聯(lián)脫細胞腦組織支架組術(shù)后第3天、1周、4周試樣周圍有少量淋巴細胞。12周時淋巴細胞明顯較前減少

8、。按照GB/T14233.2-93炎癥細胞反應分級結(jié)果顯示交聯(lián)脫細胞腦組織支架組反應程度符合國標要求，短期肌肉植入試驗合格。(2)脫細胞腦組織修復支架的細胞相容性。神經(jīng)干細胞單層培養(yǎng)：神經(jīng)干細胞單層培養(yǎng)易于得到單個神經(jīng)干細胞，通過免疫熒光檢測，結(jié)果表明：神經(jīng)巢蛋白(Neuroepithelial Stem Cell Protein，Nestin)陽性率83％，膠質(zhì)纖維酸性蛋白(Glial Fibrillary Acidic Protei

9、n，GFAP)陽性率1.8％，神經(jīng)元特異性烯醇化酶(Neuro-specific enolase，NSE)陽性率95％，5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-1-(2-deoxy—β—D—ribofuranosyl)uracil，BrdU)(+)。(3)細胞相容性：交聯(lián)支架與神經(jīng)干細胞、成纖維細胞共培養(yǎng)1周，細胞形態(tài)無明顯改變，并可見細胞增殖；神經(jīng)細胞與支架共培養(yǎng)1周未見明顯死亡。支架浸提液(1：1和1：2)培養(yǎng)和完全培養(yǎng)基培養(yǎng)神經(jīng)干細

10、胞1周，MTT結(jié)果顯示三組間無明顯差異(P=0.128)，細胞生長未受明顯抑制。神經(jīng)干細胞與交聯(lián)支架材料靜態(tài)共培養(yǎng)時，細胞增殖良好，7天時大量神經(jīng)干細胞與支架粘附，部分增殖成神經(jīng)球；HE可見細胞外基質(zhì)間大量細胞粘附；掃描電鏡下同樣可見大量神經(jīng)干細胞粘附在材料表面，部分細胞有突起生長。 結(jié)論：1.初步研制的脫細胞腦組織支架立體空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，部分保留了細胞外基質(zhì)成分，生物相容性良好。2.改良單層培養(yǎng)法可成功培養(yǎng)神經(jīng)干細胞，為實驗提供