瘤胃上皮揮發(fā)性脂肪酸吸收與生物鐘因子表達(dá)關(guān)系的研究.pdf

1、生物鐘基因廣泛存在于哺乳動(dòng)物的細(xì)胞中，胃腸道內(nèi)也存在生物鐘基因的表達(dá)，且能夠影響胃腸道內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)、以及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，不同周齡湖羊瘤胃上皮組織的生物鐘基因均能夠表達(dá)。揮發(fā)性脂肪酸(Volatile fatty acid，VFA)作為瘤胃內(nèi)發(fā)酵的主要產(chǎn)物和反芻動(dòng)物的主要能量來(lái)源，且VFA能通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以吸收進(jìn)入瘤胃上皮細(xì)胞。為此，本論文旨在初步探討在瘤胃上皮細(xì)胞的揮發(fā)性脂肪酸吸收與其生物鐘因子表達(dá)的關(guān)系。研

2、究主要包括以下部分:
　　試驗(yàn)一、山羊瘤胃上皮原代細(xì)胞的分離培養(yǎng)與生物鐘蛋白的免疫熒光鑒定
　　試驗(yàn)通過(guò)連續(xù)0.25％胰蛋白酶消化法分離瘤胃上皮原代細(xì)胞，并使用顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)、免疫熒光法鑒定細(xì)胞角蛋白18的表達(dá)、CCK8法(Cell counting8)測(cè)定細(xì)胞活性，體外添加15 mmol/L丁酸鈉測(cè)定瘤胃上皮細(xì)胞代謝丁酸的生物功能。同時(shí)，使用免疫熒光法鑒定山羊瘤胃上皮細(xì)胞的CLOCK蛋白和PERIOD2蛋白的表達(dá)。分析

3、結(jié)果:原代培養(yǎng)的瘤胃上皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)上呈鋪路石狀分布，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線呈“S”型，符合上皮細(xì)胞的典型的形態(tài)和生長(zhǎng)曲線。同時(shí)，細(xì)胞能夠陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞角蛋白18，使用含有15 mmol/L的丁酸鈉的培養(yǎng)液培養(yǎng)24h能夠極顯著提高培養(yǎng)液中β-羥丁酸的產(chǎn)量(P＜0.01)，符合瘤胃上皮細(xì)胞的生物學(xué)功能，且體外瘤胃上皮細(xì)胞能夠陽(yáng)性表達(dá)CLOCK蛋白和PERIOD2蛋白，存在生物鐘蛋白的表達(dá)。
　　試驗(yàn)二、不同揮發(fā)性脂肪酸對(duì)瘤胃上皮細(xì)胞增殖活性和吸收

4、速率的影響
　　試驗(yàn)通過(guò)體外添加15 mmol/LVFA處理瘤胃上皮細(xì)胞包括乙酸鈉、丙酸鈉、丁酸鈉處理細(xì)胞6、12、24h，使用CCK8法測(cè)定各組細(xì)胞活力，并且使用液相色譜儀測(cè)定培養(yǎng)液中的VFA濃度。VFA處理24h后使用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞周期，同時(shí)，使用RT-PCR法測(cè)定細(xì)胞周期基因的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):1）對(duì)照組的細(xì)胞活力顯著或極顯著高于VFA處理組(P＜0.05或P＜0.01)。丙酸組的細(xì)胞活力在12h和24h極顯著高于乙酸組和

5、丁酸組(P＜0.01)。2)通過(guò)細(xì)胞周期的分析，VFA處理組的細(xì)胞處在G1期的比例極顯著高于對(duì)照組，且乙酸組和丁酸組極顯著高于丙酸組(P＜0.01)。3)細(xì)胞處理24 h后，處理液中丙酸組的丙酮酸濃度極顯著高于其他組(P＜0.01)，丁酸組極顯著高于對(duì)照組和乙酸組(P＜0.01)。4)相比于對(duì)照組，VFA處理極顯著的抑制CCND1、CCNB1、CDK1和CDK2的相對(duì)表達(dá)(P＜0.01)，且能夠下調(diào)CDK4的表達(dá)，但是差異不顯著(P＞0

6、.05)。5)不同VFA的吸收速率丁酸組最高，丙酸組次之，乙酸組最慢(P＜0.01)，且培養(yǎng)液中的VFA濃度隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而極顯著下降(P＜0.01)。
　　試驗(yàn)三、瘤胃上皮細(xì)胞揮發(fā)性脂肪酸吸收蛋白和生物鐘因子表達(dá)的相關(guān)性研究
　　試驗(yàn)通過(guò)體外添加15 mmol/LVFA處理瘤胃上皮細(xì)胞包括乙酸鈉、丙酸鈉、丁酸鈉處理細(xì)胞6h、12h、24 h，研究不同VFA對(duì)細(xì)胞生物鐘和VFA吸收基因表達(dá)、以及基因表達(dá)的相關(guān)性的影響。基

7、因相對(duì)表達(dá)量通過(guò)RT-PCR法測(cè)定，基因表達(dá)量的相關(guān)性分析使用皮爾森相關(guān)分析進(jìn)行。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn):
　　1）VFA對(duì)于瘤胃上皮細(xì)胞生物鐘基因和吸收基因表達(dá)有不同程度的影響，VFA處理極顯著抑制Clock基因表達(dá)、而極顯著提高Bmal1基因和Per2基因的表達(dá)（P＜0.01），丁酸組的Per3基因極顯著高于其他組(P＜0.01)。丙酸組和丁酸組的Cry2極顯著高于對(duì)照組和乙酸組(P＜0.01)。VFA能夠顯著提高NR1D1和R

8、ORa的基因表達(dá)，降低NR2F2、FBXW11的相對(duì)表達(dá)(P＜0.05)，而對(duì)NCOR1沒有顯著影響(P＞0.05)。
　　2）VFA處理對(duì)PPAR家族的基因表達(dá)存在不同的影響，丙酸組和丁酸組能夠極顯著上調(diào)PPARA的表達(dá)(P＜0.01)，丙酸組的PPARD和PPARG的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。
　　3)VFA處理能夠極顯著提高PAT1，降低MCT1和MCT4基因的表達(dá)(P＜0.01)，而對(duì)NHE1沒有顯著的影

9、響(P＞0.05)。此外，不同VFA對(duì)于AE2、VH+ATPase的表達(dá)影響不一致。
　　4）MCT1和MCT4基因表達(dá)與生物鐘因子存在極顯著的相關(guān)性(P＜0.01)，Bmal1和PAT1的表達(dá)顯著相關(guān)(P＜0.05)。且生物鐘因子的表達(dá)與CCND1、CCNB1、CDK1和CDK2存在顯著的正相關(guān)或者負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。
　　1）使用0.25％胰蛋白酶連續(xù)消化、培養(yǎng)的瘤胃上皮細(xì)胞符合上皮細(xì)胞的形態(tài)、免疫化學(xué)、增殖活性的特

10、點(diǎn)、并且具有相關(guān)的生物學(xué)功能，證明該細(xì)胞為山羊瘤胃上皮細(xì)胞。且瘤胃上皮細(xì)胞在體外能夠陽(yáng)性表達(dá)CLOCK蛋白和PERIOD2蛋白。
　　2）VFA能夠通過(guò)下調(diào)細(xì)胞周期蛋白以及CDK的基因表達(dá)，影響細(xì)胞G0/G1期向S期轉(zhuǎn)變，從而抑制瘤胃上皮細(xì)胞DNA合成、并降低細(xì)胞增殖活力。不同VFA在體外吸收速率存在差異。
　　3）VFA對(duì)瘤胃上皮細(xì)胞的生物鐘基因和吸收基因有不同程度的影響，生物鐘基因的表達(dá)與細(xì)胞周期基因以及VFA吸收基因的