梓醇促神經(jīng)修復作用及其腦可塑性機制研究.pdf

1、目的: 1．觀察梓醇對離體培養(yǎng)的SD大鼠皮質神經(jīng)元生存活性及軸突生長的影響； 2．觀察梓醇對大鼠局灶腦缺血后神經(jīng)功能恢復有無促進作用； 3．了解梓醇能否透過血腦屏障； 4．了解梓醇能否促進腦缺血后神經(jīng)元軸突和樹突生長； 5．了解梓醇能否促進腦缺血后軸突有效芽生，增強突觸重構； 方法: 一、離體實驗研究離體培養(yǎng)SD大鼠乳鼠皮質神經(jīng)元，以不同濃度的梓醇干預培養(yǎng)至第6天的神經(jīng)元，采用MT

2、T法測定神經(jīng)元生存活力和鏡下觀察并用測微尺測量軸突長度，了解梓醇對離體培養(yǎng)神經(jīng)元軸突生長的影響。 二、在體實驗研究 1．開顱法制備SD大鼠局灶性永久性腦缺血模型。造模成功后分為模型組、生理鹽水組、梓醇低、中、高劑量治療組和胞磷膽堿陽性藥物對照組，同時設立假手術組為對照。以腹腔注射給予不同劑量梓醇為干預措施，首次給藥時間分為腦缺血后 6h 或腦缺血后24h，每天給藥一次，連續(xù)7天； 2．采用Bederson 評分、

3、肌力測試、平衡木試驗和前肢技巧性食物抓取試驗評價各組神經(jīng)功能恢復狀況； 3．采用高效液相色譜技術定性檢測梓醇能否進入腦脊液； 4．采用Golgi-Cox染色顯示神經(jīng)元樹突和樹突棘，觀察梓醇對神經(jīng)元樹突生長的影響； 5．采用免疫熒光組化和 Western blot 檢測新生軸突和突觸分子標志GAP-43和P38蛋白表達，觀察梓醇對腦缺血后神經(jīng)元軸突新生和突觸重構的影響； 6．采用電鏡技術觀測大腦皮質神經(jīng)氈內

4、突觸數(shù)目，觀察梓醇對腦缺血后神經(jīng)元超微結構的影響； 7．采用神經(jīng)示蹤和免疫熒光雙標技術顯示脊髓頸膨大區(qū)皮質脊髓束芽生纖維以及腦缺血灶周圍殘存大腦皮質與健側感覺運動皮質區(qū)的纖維聯(lián)系，觀察梓醇對長距離軸突芽生的影響； 8．采用免疫熒光組化和Western blot檢測各實驗組Nogo A、NgR、BDNF和trkB蛋白表達變化，初步探討梓醇促神經(jīng)修復作用分子基礎。 結果: 一、離體實驗結果顯示，梓醇對神經(jīng)元生

5、存活性無明顯影響。 二、在體實驗結果 1．證實梓醇對腦缺血后功能恢復有促進作用。梓醇對腦缺血后感覺運動功能恢復有促進作用。腦缺血后延遲給予梓醇治療仍促進大鼠功能恢復。 2.梓醇能夠通過血腦屏障給藥后40min的大鼠腦脊液，HPLC法檢測分析發(fā)現(xiàn)在保留時間為10.4min處可見梓醇的紫外吸收峰，與腦脊液加樣對照梓醇的紫外吸收峰保留時間相同，表明給藥后梓醇分布到大鼠腦脊液中。 3.梓醇促進大鼠腦缺血后神經(jīng)元軸

6、突和樹突生長作用及可能機制 (1)梓醇促進缺血灶周圍大腦皮質GAP-43蛋白表達GAP-43是神經(jīng)元新生軸突的分子標志。梓醇對神經(jīng)元軸突新生有促進作用。 (2)腦缺血后缺血灶周圍大腦皮質神經(jīng)元樹突分支和樹突棘密度均明顯減少；梓醇可促進樹突分叉，增加樹突棘密度。 (3)梓醇增強缺血灶周圍大腦皮質芽生軸突與健側感覺運動皮質區(qū)的聯(lián)系綠色熒光顯示BDA標記的神經(jīng)細胞和纖維，綠色熒光強度系數(shù)越大反映缺血灶周圍大腦皮質內BD

7、A標記纖維的數(shù)量越多。紅色熒光標記GAP-43表達陽性的神經(jīng)細胞和軸突，紅色熒光強度系數(shù)越大反映缺血灶周圍大腦皮質具有生長反應的神經(jīng)細胞和新生突纖維的數(shù)量越多。兩者共定位呈黃色，顯示缺血灶周圍皮質新生的芽生軸突已經(jīng)與健側感覺運動皮質建立纖維聯(lián)系；Person 相關系數(shù)反映芽生軸突被BDA標記的頻度，其值越大反映缺血灶周圍皮質芽生軸突與健側感覺運動皮質區(qū)的纖維聯(lián)系越密切。結果綠色熒光強度系數(shù)各實驗組間無明顯差異(p>0.05)，紅色熒光強

8、度系數(shù)梓醇中劑量組明顯大于假手術組、模型組、生理鹽水組和胞磷膽堿組(p<0.05)，提示梓醇可明顯促進缺血灶周圍皮質神經(jīng)元軸突芽生。Pearson 相關系數(shù)模型組較假手術組明顯增加(p<0.05)，梓醇中劑量組明顯大于模型組和胞磷膽堿組(p<0.05)。 (4)梓醇增加脊髓頸膨大區(qū)健側皮質脊髓束越邊纖維數(shù)量大鼠皮質脊髓束在脊髓頸膨大節(jié)段集中走行在脊髓后(背)索。正常情況下，皮質脊髓束絕大部分纖維發(fā)枝支配同側脊髓前角，很少越邊支配

9、對側脊髓前角。腦缺血后，模型組健側皮質脊髓束越邊纖維占4.7％±1.3％，較假手術組1.4％±0.5％明顯增加(p<0.05)，提示健側大腦半球感覺運動皮質在腦缺血后功能恢復過程可能發(fā)揮重要作用。梓醇干預后，健側皮質脊髓束越邊纖維占8.5％±2.1％，較模型組和胞磷膽堿組(5.5％±1.8％)明顯增加(p<0.05)。 (5)梓醇促進脊髓頸膨大區(qū)健側皮質脊髓束纖維芽生用綠色熒光顯示 BDA 標記的健側皮質脊髓束，紅色熒光顯示GA

10、P-43表達陽性的新生軸突纖維，BDA/GAP-43共定位后呈黃色，BDA/GAP-43共定位分析，紅色熒光強度系數(shù)越大GAP-43表達水平越高；Person 相關系數(shù)越大脊髓頸膨大區(qū)健側皮質脊髓束新生的芽生軸突越多。模型組紅色熒光強度系數(shù)明顯大于假手術組(p<0.05)；梓醇組較其他各實驗組均明顯增大(p<0.05)；模型組 Pearson 相關系數(shù)明顯大于假手術組(p<0.05)，梓醇組較模型組和胞磷膽堿組均明顯增大(p<0.05)

11、。 (6)梓醇下調健側大腦皮質Nogo-A蛋白表達 Nogo-A陽性細胞呈現(xiàn)紅色，分布在損傷側和健側大腦皮層、海馬、紋狀體等腦區(qū)。大腦皮層Nogo-A陽性細胞數(shù)(個/視野)假手術組為56．33±5．51，模型組為213．33±3．78，差異具有顯著性(p<0.05)；梓醇中、高劑量組分別為121．5±8．35和100．33±7．5 1，均比模型組、生理鹽水組和胞磷膽堿組明顯減少(p<0.05)。Westen blot檢測結果與此

12、相符。 (7)梓醇下調健側大腦皮質NgR蛋白表達損傷側和健側大腦皮層、海馬、紋狀體等腦區(qū)均可見NgR陽性細胞，胞漿和突起呈綠色，細胞核未著色，具有神經(jīng)元的典型形態(tài)特征。健側大腦皮質NgR陽性細胞數(shù)假手術組、模型組和生理鹽水組組間差異無顯著性(p>0.05)，提示腦缺血后15天，大腦皮質內NgR表達水平接近正常生理狀態(tài)。梓醇中、高劑量組NgR陽性細胞數(shù)均比模型組、生理鹽水組和胞磷膽堿組明顯減少(p<0.05)。Westen blo

13、t檢測結果與NgR原位檢測結果相符。 4．梓醇對大鼠腦缺血后突觸重構的誘導作用及可能機制 (1)梓醇上調腦缺血后腦內突觸素蛋白表達突觸素(P38)是突觸的分子標志，用FITC標記，呈現(xiàn)綠色熒光。陽性著色部位呈大小較均勻的點狀或顆粒狀，主要分布在神經(jīng)氈內。 陽性著色部位IOD值模型組和生理鹽水組與假手術組差異無顯著性(P>0.05)，梓醇中、高劑量組均顯著高于模型組和胞磷膽堿組(p<0.05)。Western bl

14、ot半定量分析結果與此基本一致。提示梓醇能上調腦缺血后腦內突觸素蛋白表達。 (2)梓醇增加大腦感覺運動皮質神經(jīng)氈內突觸數(shù)目電鏡下，感覺運動皮質神經(jīng)氈內突觸數(shù)目除假手術組外，各實驗組缺血側均比健側減少。模型組健側神經(jīng)氈內突觸數(shù)目與假手術組差異無顯著性(p>0.05)，但缺血側明顯少于假手術組(p<0.05)，提示腦缺血后存在突觸丟失現(xiàn)象；梓醇中劑量組健側和缺血側均比模型組和生理鹽水組明顯增加(p<0.05)，但與胞磷膽堿組差異無顯

15、著性(p>0.05)，提示梓醇對腦缺血后突觸重構有明顯促進作用。 (3)梓醇促進缺血灶周圍大腦皮質新生軸突形成突觸連接綠色熒光顯示P38標記的突觸前末端，紅色熒光顯示GAP-43表達陽性的軸突纖維，GAP-43/P38共定位后呈現(xiàn)黃色，顯示新生軸突形成的突觸末端。用Pearson相關系數(shù)反映GAP-43/P38共定位頻度。Pearson 相關系數(shù)越大說明新生軸突形成突觸越多。模型組和生理鹽水組Pearson相關系數(shù)明顯大于假手術

16、組(p<0.05)，提示腦缺血可刺激新生軸突形成突觸連接；梓醇各劑量組均比模型組明顯增大(p<0.05)，且梓醇中、高劑量組明顯大于胞磷膽堿組(p<0.05)。提示梓醇可增強腦缺血后新生軸突形成新的突觸連接，促進腦缺血后有效軸突芽生。 (4)梓醇上調缺血灶周圍大腦皮質BDNF蛋白表達BDNF陽性細胞被Cy3標記，胞漿和突起呈現(xiàn)紅色，胞核不著色，陽性細胞主要為神經(jīng)元。BDNF陽性細胞數(shù)模型組和生理鹽水組均較假手術組明顯增加(P<0

17、.05)，提示腦缺血后BDNF表達上調；梓醇治療組均比模型組明顯增加(P<0.05)，且梓醇中、高劑量治療組也比胞磷膽堿組明顯增加(P<0.05)。Western blot檢測結果與此相符。提示梓醇可上調腦缺血后BDNF蛋白表達。 (5)梓醇上調缺血灶周圍大腦皮質TrkB蛋白表達TrkB陽性細胞胞漿和突起被FITC標記，呈現(xiàn)綠色，胞核不著色。缺血灶周圍大腦皮質TrkB陽性細胞數(shù)模型組較假手術組有減少趨勢，但差異無顯著性(P>0.